Начните с прикрепления магнитного сепаратора к подставке. Подсоедините селекционную колонку к магнитному сепаратору и поместите сетчатый фильтр 70 микрон на верхнюю часть селекционной колонки. Поместите трубку объемом 50 миллилитров под колонку выбора, чтобы собрать поток.
Как только клетки мозга мыши достигнут 80% конфлюенции, аспирируйте среду и промойте клетки PBS. Добавьте 0,25% трипсина, чтобы отделить адгезивные клетки, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте буфер остановки.
Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут, и удалите надосадочную жидкость. Для окрашивания антителами ресуспендируйте от 10 до семи клеток в 100 микролитрах PBS. Затем добавьте 10 микролитров раствора антитела LYVE-1 и тщательно перемешайте.
Выдержите смесь в течение 30 минут в темноте при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации центрифугируйте клетки и выбросьте надосадочную жидкость. Затем промойте клетки, добавив один миллилитр PBS и центрифугируя при 300 G в течение пяти минут.
Для маркировки микрогранул повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах PBS и 20 микролитрах микрогранул. Сделать набухание и выдержать 30 минут в темноте при четырех градусах Цельсия. Затем центрифугируйте суспензию и промойте гранулу одним миллилитром PBS.
Снова центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулу в четырех миллилитрах PBS для магнитного отрицательного исключения. Пропустите клеточную суспензию через сетчатое фильтр 70 микрон, чтобы удалить комки. Подготовьте колонку для выбора, промыв ее тремя миллилитрами PBS.
Затем добавьте суспензию ячеек в столбец выделения. Промойте колонку тремя миллилитрами PBS и соберите отрицательные клетки LYVE-1 в 50-миллилитровую пробирку. Для магнитного положительного отбора пипеткой введите шесть миллилитров PBS в колонку для отбора.
Затем промойте магнитно меченые клетки, сильно вдавливая поршень в колонку для отбора, чтобы получить LYVE-1 положительные LLEC. Далее центрифугируют положительную клеточную суспензию и удаляют надосадочную жидкость. Пластину с 10 до пятой клетки на квадратный сантиметр в колбу Т25 с пятью миллилитрами питательной среды.
Поддерживайте культуру, заменяя 50% среды через день. Когда клетки достигнут 80% конфлюенции, отделите их, как было показано ранее, перед выполнением пассажа клетки. Анализ проточной цитометрии показал, что процент положительных клеток LYVE-1 во втором пассаже существенно не отличался от третьего пассажа после MACS, что указывает на чистоту более 95%. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило совместное окрашивание LYVE-1 с PDPN, VEGFR-3 и PROX1, установив идентичность LLEC.
LYVE-1 положительные клетки не экспрессировали F48 и тромбоцитарный фактор роста бета, эффективно отличая LLEC от макрофагов и фибробластов. Лептоменингеальные клетки до MACS демонстрировали гетерогенную морфологию, варьирующуюся от круглых сфер до форм слитых волокон. Тем не менее, после MACS LLEC демонстрировали типичные эндотелиальные особенности, такие как формы веретена и булыжника.
