Дегенерация палочек у головастиков Xenopus с помощью CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута родопсина

Для начала возьмите заточенный капилляр, с помощью наконечника микрозагрузчика загрузите от 2 до 10 микролитров рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR Cas9 или контрольного раствора. После этого поместите заполненный капилляр в обработчик микроинжектора. Отломайте кончик капилляра тонкими щипцами, чтобы отрегулировать объем выброса на уровне 10 нанолитров.

Поместите эмбрионы одной клеточной стадии на сетку, склеенную в 100-миллиметровую чашку Петри с 3%-ным раствором полисахарозы. С помощью микроинжектора и под стереомикроскопом введите 10 нанолитров раствора в область коры головного мозга, в частности, на уровне полюса животного под цитоплазматической мембраной. Через 24 часа визуализируйте флуоресцеин, лизин, декстрин под флуоресцентным стереомикроскопом и выберите хорошо введенные эмбрионы рокрипанта.

Мечение сетчатки головастика с помощью каспазы 3 показало, что некоторые палочки подвергаются апоптозу. Гистологическое окрашивание показало глобальное сохранность ядерных слоев, но сильное укорочение наружных сегментов фоторецепторов. Дальнейший иммуноокрашивающий анализ с помощью фоторецепторных маркеров показал дегенерацию наружных сегментов палочек.