Начните с встраивания легочной ткани и агарозы и ее разрезания с помощью вибратома. К нарезанным тканям добавьте 300 микролитров блокатора. Выдержите тарелку при температуре четыре градуса Цельсия в шейкере с легким помешиванием в течение 45 минут.
Далее пипеткой в каждую лунку ввели 300 микролитров разведенного первичного антитела PBS. Выдержите тарелку в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, слегка встряхивая. Теперь аккуратно выведите пипеткой первичные антитела, не касаясь среза.
Вымойте ломтики три раза 400 микролитрами PBS. Далее пипеткой в каждую лунку впрыскиваем по 300 микролитров разведенных вторичных антител. Удалите раствор антител после холодной инкубации в течение 90 минут.
Затем добавьте в лунки DAPI и томатный лектин 488. Выдерживайте смесь в течение 30 минут. После удаления DAPI и томатного лектина промойте ломтики в PBS в течение трех циклов по 10 минут.
С помощью кисточки переложите ломтики на предметную горку. Поместите три капли монтажного материала на предметное стекло и наденьте на него защитное стекло перед съемкой. Срезы легких образцов мышей, свиней и человека были иммунофлюоресцентно окрашены на СМА, эластин и ЛЭА.
Наблюдалось, что СМА и эластин распределяются по таким структурам, как альвеолярные протоки, кровеносные сосуды, бронхиолы и альвеолы. Проведено сравнение распределения пневмоцитов II типа у взрослого и младенческого человека. Антитело к альвеолярным клеткам II типа HT2-280 обладало сильным сродством к поверхности клеток пневмоцитов.
В образце младенцев было обнаружено значительно более высокое количество пневмоцитов II типа. Тем не менее, образец для младенцев также продемонстрировал значительно более высокое покрытие скаффолда, чем взрослый. Количество пневмоцитов II типа на основе покрытия скаффолдом также было значительно выше у младенцев.
