Начните разведение образца сыворотки человека, смешав пять микролитров образца сыворотки со 120 микролитрами буфера для анализа в 96-луночном планшете. Разбавьте еще до восьми раз, смешав 10 микролитров исходного разведения с 70 микролитрами буфера для анализа. Теперь приготовьте 100 микролитров смеси шариков, содержащей шарики, сопряженные с целевым антигеном.
Далее разведите приготовленную бусинную смесь в 2,4 миллилитрах пробирного буфера в пробирке Falcon. Начинайте инкубацию сыворотки с пипетирования 25 микролитров суспензии в специально отведенных лунках. Добавьте в лунки с шариковой суспензией 25 микролитров разведенной в 200 раз сыворотки.
Накройте 96-луночный реакционный планшет уплотнением микропланшета. Затем инкубируйте тарелку с бусинами на тарелочном шейкере. После инкубации извлеките 96-луночную реакционную пластину из вибростенда.
Поместите пластину в магнитную шайбу для пластин и снимите клейкую пломбу. Затем трижды промойте бусины 100 микролитрами буфера для промывки, затем отасуньте окончательный объем промывки из бусин после последнего этапа промывки. Для первой инкубации антител начните с приготовления свежей смеси реагентов двойного обнаружения IgG и IgM в буфере для анализа.
Внесите пипеткой по 30 микролитров реагента для обнаружения в каждую предназначенную лунку, затем накройте 96-луночную реакционную пластину уплотнением микропланшета. Инкубируйте тарелку на шейкере в течение 45 минут при температуре 20 градусов Цельсия при 750 оборотах в минуту. После инкубации поместите планшет в магнитную шайбу для планшетов, и снимите с клейкой пластины пломбу пипетки 30 микролитров разбавленного BV421-меченного стриптавидина в каждую реакцию, хорошо после промывки планшетов, как и раньше.
Затем поместите герметичную тарелку на шейкер для тарелок для последующей инкубации. После завершения инкубации промойте планшет и снова суспендируйте шарики в лунках до конечного объема 100 микролитров с помощью промывочного буфера. Чтобы проанализировать результаты, накройте 96-луночный реакционный планшет уплотнением микропланшета.
Далее инкубируйте накрытую пластину в течение трех минут при температуре 20 градусов Цельсия со скоростью 1000 оборотов в минуту на встряхивателе для тарелок. Перенесите пластину из шейкера в двухрепортерный анализатор потока. Наконец, оцените медианную интенсивность флуоресценции образца, или MFI, следуя инструкциям производителя.
Корреляционный анализ Спирмена для трех репрезентативных антигенов Borrelia продемонстрировал равномерную воспроизводимость значений MFI при обнаружении антител против Borrelia, присутствующих в сыворотках крови человека. Двойной репортерный анализ показал хорошую воспроизводимость от анализа к анализу с высокой точностью межанализа, продемонстрированную диаграммами Леви-Дженнингса. При разведении образца от 100 до 12 800 раз кривые разведения как для обнаружения IgM, так и для обнаружения IgG были одинаковыми для обоих приборов.
Значения MFI были немного выше в инструменте с одним репортером.
