Проточный цитометрический анализ митофагии в β-клетках поджелудочной железы мыши с использованием генетически кодируемого репортера mt-keima

Для оценки митофагии в бета-клетках поджелудочной железы мышей с использованием генетически кодируемого репортера митофагии культивировали островки поджелудочной железы, выделенные от мышей дикого типа и Mt-Keima, в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день добавьте 100 островков в шестисантиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитра островковой среды для каждого экспериментального условия, используемого в этом протоколе. Затем диссоциировать люверсы на отдельные клетки и окрашивать с помощью FluoZin-3-AM и DAPI, как было продемонстрировано ранее для подхода на основе красителя Mt-Phagy.

Затем приступают к проточному цитометрическому анализу образцов. Отрегулируйте напряжение прямого рассеяния или FSC и напряжение бокового рассеяния или SSC, чтобы добиться равномерного распределения ячеек на графике SSCA и FSCA. Чтобы выбрать отдельные ячейки и исключить кратные, добавьте прямоугольный стрит в зависимости высоты FSC от ширины FSC, а затем высоту SSC от ширины SSE.

Мультиплеты исключены из-за их большей ширины сигнала. Затем настройте отрицательный вентиль DAPI для исключения мертвых клеток. После этого настройте положительные вентили FluoZin-3-AM для фильтрации живых бета-клеток.

Настройте схему треугольного стробирования с использованием положительного образца Mt-Keima для определения кислотных и нейтральных клеточных популяций. После установления первичных и флуоресцентных ворот оцените поток митофагии с использованием базальных и вызванных валиномицином изменений флуоресценции Mt-Keima.