Начните с размораживания замороженных носителей растворенных веществ или гранул SLC-клеток на водяной бане при комнатной температуре. Приготовьте солюбизационный буфер, соединив 135 миллилитров базового буфера и три коктейльные таблетки ингибитора протеазы. После того, как таблетки растворятся, повторно суспендируйте гранулу в буфере для солюбилиза.
Затем добавьте дезаминазу и переложите суспензию в охлажденный гомогенизатор со льдом. Гомогенизируйте раствор, перемещая поршень вверх и вниз примерно 20 раз, удерживая гомогенизатор на льду. Далее добавьте моющий исходный раствор до 1% конечной концентрации.
Переложите смесь для солюбилизации в коническую трубку объемом 50 миллилитров и медленно вращайте со скоростью четыре градуса Цельсия. Через час центрифугируйте смесь и соберите надосадочную жидкость. Уравновесьте объем слоя стрептококк смолы стрепток-тактина объемом от четырех до шести миллилитров с базовым буфером.
Затем добавьте в растворимую надосадочную жидкость уравновешенную смолу, и вращайте в течение двух часов при температуре четыре градуса Цельсия. Вылейте раствор на колонну самотечного потока и дайте раствору пройти. Промойте смолу в 30 раз больше объема слоя Strep Wash Buffer в три равных этапа.
Далее добавьте от трех до пяти миллилитров иллюзионного буфера и инкубируйте в течение 15 минут, прежде чем собрать элюй. Измерьте концентрацию белка с помощью УФ-абсорбирующей спектроскопии. Соедините нужные фракции иллюзии, и добавьте 3С протеазу.
Медленно вращайте трубку в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день уравновесьте от двух до четырех миллилитров объема слоя аффинной смолы металлического кобальта с буфером SEC. Добавьте уравновешенную смолу сродства к металлическому кобальту в смесь для ночной реакции 3C и вращайте со скоростью четыре градуса Цельсия.
Через час вылейте раствор в колонну самотечного потока и соберите поток. Сконцентрируйте поток в 100-килодальтонном отсечном центробежном фильтре путем вращения при 3000 g при четырех градусах Цельсия. Уравновешенная колонна SEC на основе декстрана argos с буфером SEC.
Введите образец в контур отбора проб и запустите программу SEC со скоростью потока, таким образом, чтобы давление в колонке было ниже спецификаций производителя колонки. С помощью сборщика фракций соберите 300 микролитровых фракций за весь прогон SEC. После объединения пиковых фракций измерьте поглощение на 280 нанометрах.
Затем сконцентрируйте образцы до необходимого объема в фильтре с отсечкой 100 килодальтон. Первоначальная экспрессия белка SLC в малых масштабах была проанализирована с помощью электрофореза страницы SDS. Флуоресцентная микроскопия A GFP, меченного SLC, подтвердила локализацию белка, специфичную для плазматической мембраны со значительным внутриклеточным накоплением.
Химически и структурно однородный белок дал один монодисперсный пик A280 во время эксклюзионной хроматографии.
