Для начала возьмите мышь, находящуюся под наркозом, и нанесите одну каплю 1% тропикамида и 2,5% фенилэфрина в глаз, чтобы расширить зрачок. Затем нанесите на роговицу офтальмологический гель, чтобы предотвратить сухость и индуцированную анестезией катаракту. Затем установите вертикальный операционный микроскоп с прямым световым путем в стерильной среде для выполнения субретинальной инъекции.
Чтобы приготовить стеклянный шприц объемом 10 микролитров, отсоедините ступицу иглы и прикрепите тупую иглу 33 калибра. Возьмите металлическую крышку ступицы и надежно закрепите иглу на шприце. Промойте иглу дистиллированной водой, чтобы проверить утечку и проходимость иглы.
Затем опорожните шприц и осторожно отложите его в сторону. Затем поместите мышь под наркозом на подушку и направьте глаз на объектив микроскопа. Нанесите 0,5% пропаракаина гидрохлорида и подождите 30 секунд.
Затем нанесите на глаз 150 микролитров офтальмологического геля и прикрепите круглую покровную пластинку. Проведите предварительное обследование глаз, наблюдая за роговицей, радужной оболочкой, зрачком, хрусталиком и конъюнктивой. Отрегулируйте фокальную плоскость, чтобы визуализировать глазное дно глаза мыши через зрачок.
Затем выровняйте головку так, чтобы оптическая головка совпала с центром зрачка. После этого постучите по основанию пробирки, содержащей предшественники фоторецепторов, полученных из HESC, чтобы получить однородную клеточную суспензию. С помощью стеклянного микролитрового шприца объемом 10 микролитров с тупой иглой 33 калибра наберите два микролитра клеточной смеси.
Используйте одноразовую иглу 30 калибра для создания склерэктомической раны, расположенной на два миллиметра позади лимба. Поддерживайте угол наклона иглы примерно 45 градусов, чтобы предотвратить контакт с линзой. Как только кончик иглы станет виден в глазу, осторожно втяните иглу.
Выбросьте использованную иглу в острую корзину, чтобы предотвратить травмы от укола иглой. Теперь возьмите стеклянный шприц и введите тупую иглу в рану от склерэктомии. Продвигайте тупую иглу, не касаясь линзы, пока она не достигнет противоположной сетчатки входной раны.
Мягко проникайте в сетчатку до тех пор, пока не будет видна давящая ветвь на склере. Затем введите два микролитра клеточной суспензии или среды PRDM в субретинальное пространство, сохраняя при этом мягкое давление на шприц. Образование видимого пузырька свидетельствует об успешной инъекции.
Подождите 10 секунд, чтобы клетки успокоились. Аккуратно отведите иглу от ушка. Чтобы визуализировать пузырь, переместите головку мыши, чтобы расположить глаз под микроскопом, и закрепите положение, осторожно удерживая головку.
Для интраоперационной ОКТ используйте функцию ИОКТ на операционном микроскопе и выберите куб на экране ОКТ. Расположите область сканирования на шарике, нажимая кнопки со стрелками. Чтобы отрегулировать ОКТ, центрирование слайда и сфокусироваться для достижения наилучшего качества ОКТ, нажмите кнопку «Захват» или «Сканировать», чтобы получить ОКТ-скан области пузырька, и просмотрите изображения, чтобы проверить качество сканирования.
Наконец, снимите чехол и аккуратно смойте гель с глаза с помощью марли. Введите мазь с антибиотиком один раз после инъекции для предотвращения инфекции. ОКТ-сканирование выявило отчетливые HESC-сущности, взвешенные в глазу, подвергшемся лечению клетками.
Напротив, глаз, обработанный средой, отображал незамутненную жидкость, лишенную клеток в субретинальном пространстве.
