После культивирования размороженного криоконсервированного образца крови облучают его необходимыми рентгеновскими дозами при комнатной температуре. Затем добавьте в каждую лунку по 1,62 миллилитра теплой питательной среды RPMI. Чтобы стимулировать деление клеток в Т-лимфоцитах, добавьте в каждую лунку по 40 микролитров фитогемагглютинина и тщательно ресуспендируйте.
Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 23 часов. На следующий день добавьте восемь микролитров цитохалазина В на лунку, чтобы заблокировать цитокинез. Через 70 часов извлеките пластину из инкубатора и переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.
Промойте каждую лунку двумя миллилитрами PBS и добавьте этот PBS в 15-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте клеточную суспензию при 180 G в течение восьми минут и выбросьте надосадочную жидкость, оставив 500 микролитров над гранулой. Во время вихряния гранулы добавьте в пробирку два миллилитра холодного хлористого калия.
Снова центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, как было показано ранее. Медленно добавьте два миллилитра фиксатора холода 1 и инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса по Цельсию. На следующий день центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.
Перемешивая гранулы по каплям, добавьте в тюбик два миллилитра фиксатора холода 2. Оставьте тюбик на ночь при температуре четыре градуса по Цельсию. Центрифугируйте образец и перелейте надосадочную жидкость в другую пробирку, чтобы концентрировать клетки в соответствии с размером гранул.
Очистите предметные стекла изопропанолом и наклейте на них надлежащую маркировку. После вихряния гранулы добавьте 40 микролитров суспензии с фиксированными клетками на предметное стекло. После высыхания погрузите предметное стекло в акридиновое оранжевое пятно на одну минуту.
Затем быстро промойте предметное стекло дистиллированной водой, прежде чем поместить его в фосфатный буфер на одну минуту. Высушите заднюю часть предметного стекла и положите его на чистую папиросную бумагу. Добавьте 20 микролитров фосфатного буфера на предметное стекло и накройте его чистым покровным стеклом, избегая пузырьков воздуха.
Запечатайте предметную горку силиконовым цементом. Поместите предметное стекло под флуоресцентный микроскоп и исследуйте двуядерные клетки. Наконец, вручную подсчитайте микроядра.
Наличие округлых двуядерных клеток указывало на успешное извлечение здоровых жизнеспособных клеток из криоконсервированных образцов цельной крови. При увеличении доз облучения наблюдалось линейное квадратичное увеличение выхода микроядер. Фоновый выход микроядер в фиктивно-облученных контрольных образцах в основном обусловлен запаздывающими хромосомами.
