Чтобы подготовить лунки для культуры, пометьте крышку 24-луночного планшета кодом донора А или В, датой и дозой. Извлеките криопробирки с человеческой кровью из жидкого азота и частично разморозьте их на теплой водяной бане до тех пор, пока не появятся мелкие кристаллы льда. Далее в ламинарном колпаке осторожно откройте флакон, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха внутрь пробирки.
Ресуспендируйте и перелейте содержимое флакона в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Осторожно вкручивая трубку, по каплям добавьте один миллилитр предварительно подогретого ПБС. Используйте пипетку P-1000 для смешивания PBS и крови.
Для разбавления и равномерной стирки добавьте в 15-миллилитровую пробирку семь миллилитров предварительно подогретого ПБС и перемешайте пипеткой. Центрифугируйте кровь при 180 г в течение восьми минут. Тем временем заполните немаркированные лунки 24-луночной тарелки 500 микролитрами PBS и предварительно нагрейте пластину до 37 градусов по Цельсию.
После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость, оставив примерно один миллилитр в пробирке, не нарушая палитру. С помощью пипетки ресуспендируйте палитру в оставшейся надосадочной жидкости. Затем постепенно добавьте в пробирку восемь миллилитров теплого PBS, как было показано ранее.
Центрифугируют ресуспендированную кровь. Тем временем добавьте 200 микролитров питательной среды RPMI в отмеченные лунки и предварительно нагрейте планшет, как показано на рисунке. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость, оставив примерно 80 микролитров надосадочной жидкости.
Затем добавьте 280 микролитров фетальной сыворотки теленка и снова суспендируйте палитру. Перенесите 180 микролитров клеточной суспензии в отмеченные лунки. Инкубируйте планшет в углекислотном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут.
