Для начала поместите окрашенные гематоксилином и эозином срезы слизистой оболочки носа крысы на предметный столик под микроскопом. Отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока изображение не станет четко видимым. Сделайте снимок ткани с 40-кратным увеличением.
Нагрейте цитратфосфатный буфер до кипения. Затем добавьте горки в емкость, сняв ее с огня. Нагрев в течение восьми минут до закипания, выключите огонь на восемь минут и впоследствии переключитесь на средний слабый огонь на семь минут.
Дав емкости остыть естественным образом, переложите ломтики в PBS. С помощью обесцвечивающего шейкера встряхивайте ломтики в течение пяти минут. Далее обведите круг вокруг высушенной ткани иммуногистохимической ручкой.
Добавьте 3% раствор перекиси водорода в ломтики перед инкубацией. Затем переложите ломтики в PBS для промывки, как и раньше. Чтобы блокировать, нанесите 5%-ную сыворотку козы внутри отмеченного круга.
После инкубации осторожно удалите блокирующий раствор и добавьте в срезы тканей один-два миллилитра FOXP3. Затем поместите ломтики во влажную камеру для ночной инкубации. Промыв ломтики в PBS, аккуратно промокните ломтики насухо фильтровальной бумагой.
Затем добавьте к ломтикам один-два миллилитра раствора вторичного антитела. Далее инкубируйте срезы в 100 микролитрах тирамида сигнальным усилителем рабочего раствора в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации промойте ломтики PBS три раза по пять минут каждый.
Теперь нанесите на срезы один-два миллилитра красящего раствора DAPI перед инкубацией. Погасите автофлуоресценцию, инкубируя ломтики в тушителе в течение пяти минут перед 10-минутной промывкой PBS. Затем запечатайте их антифлуоресцентным гасителем.
Сделайте микроскопические снимки окрашенных участков при 20-кратном и 40-кратном увеличении. Окрашивание гематоксилином и эозином контрольных крыс показало хорошо расположенные эпителиальные клетки и реснички. Слизистая оболочка носовой перегородки была повреждена и отделена в группе заболевания с выраженной инфильтрацией нейтрофилов.
Мультииммунофлуоресцентное окрашивание показало, что экспрессия ROR Gamma T и TCAM1 была повышена в группе заболевания. Однако FOXP3 был недостаточно выражен.
