Для начала убедитесь, что пластины сканера готовы к работе с загруженными нематодами. В целом, около 40 животных и 200 микролитров бактериального газона на тарелку являются оптимальными условиями для эксперимента длиною в жизнь. Начните экспериментальную установку, нанеся средство для защиты от запотевания стекол на обе стороны стекол, которые будут поддерживать пластины сканера.
Затем нанесите защитное гидрофобное стекло на ту сторону стекла, которая будет соприкасаться с пластинами сканера. Подождите от пяти до 10 минут и удалите остатки со стекла. Нанесите 70%-ный этиловый спирт для дезинфекции той стороны стекла, которая будет соприкасаться с пластинами сканера.
Оставьте на одну-две минуты, а затем удалите этанол тканью или бумажным полотенцем. Чтобы загрузить пластины на сканеры, поместите резиновые коврики для автоклава поверх обработанного опорного стекла пластины. Возьмите пластины сканера, используемые для визуализации с загруженными нематодами, и снимите крышку.
Положите пластины на резиновый коврик лицом к стеклянной поверхности. Отключите вентиляторы сканера, чтобы защитить пальцы экспериментатора во время загрузки пластины. Осторожно сдвиньте пластины и поддерживающие их стеклянные листы на поверхность сканера.
Снова включите вентиляторы сканера и убедитесь, что передний и боковой вентиляторы включены. Включите сканеры на этом этапе. Перед началом эксперимента выполните основные действия перед получением изображения, включая получение предварительного изображения всей поверхности сканера.
С помощью веб-интерфейса найдите на главной странице раздел получения изображений и перейдите по ссылке Capture Devices and Image Servers. В открывшемся окне нажмите на поиск новых устройств и убедитесь, что каждый сканер, подключенный к серверу, отображается в окне устройств захвата изображений. Установите флажок, соответствующий каждому сканеру, содержащему только что загруженные пластины, а затем нажмите кнопку запроса предварительного просмотра.
Затем в браузере Worm выберите файл открыть изображение, а затем выберите нужное изображение, чтобы открыть каждое изображение для предварительного просмотра. Для каждого изображения щелкните мышью, чтобы выбрать столбцы, соответствующие областям, содержащим пластины. После того, как все изображения определены, выберите получение изображений.
Определите области сканирования, сохраните выбранные области сканирования на диске, а затем выберите нужное местоположение для экспорта спецификаций региона на диск. Соберите файл, содержащий название эксперимента, физическое расположение каждого столбца на сканерах, общую продолжительность эксперимента и частоту захвата изображений. Сохраните его в виде текста и XML-файла.
В браузере Worm нажмите кнопку Получение изображения, отправьте расписание эксперимента и выберите сгенерированный XML-файл. Браузер-червь спросит, следует ли вывести сводку по расписанию или запустить эксперимент. Сгенерируйте сводный файл, проверьте даты запланированных снимков, местоположение, название и количество сканеров в сводке.
Снова загрузите XML-файл для расписания эксперимента, как показано ниже. Браузер Worm во второй раз выдаст запрос на вывод сводки по расписанию или на запуск эксперимента. На этот раз выберите запуск эксперимента.
Теперь машина с длительным сроком службы будет работать автономно до тех пор, пока не будут завершены окончательные сканирования, указанные в расписании эксперимента. После завершения эксперимента и выполнения всех шагов по получению изображений и почтовых отправлений вручную проверьте автоматические результаты с помощью браузера Worm. В меню браузера Worm нажмите на файл, выберите текущий эксперимент и выберите нужный эксперимент.
Чтобы создать раскадровку, нажмите кнопку «Проверка», просмотрите весь эксперимент, а затем выберите его сразу после смерти каждого червя. Щелкните правой кнопкой мыши изображение объекта, чтобы исключить из раскадровки объекты, не являющиеся червями. Чтобы исключить все объекты на странице одновременно, зажмите клавишу Control и щелкните правой кнопкой мыши по любому объекту.
Дважды щелкните правой кнопкой мыши, чтобы повторно включить исключенный объект в анализ. Чтобы сохранить аннотации, сделанные во время раскадровки, нажмите на кнопку сохранить. Щелкните левой кнопкой мыши один раз любой объект раскадровки, чтобы открыть новое окно, в котором отображаются подробные сведения о временных рядах этого объекта.
Чтобы вручную аннотировать время смерти, щелкните левой кнопкой мыши по нижней панели в точке, соответствующей времени смерти. Используйте пробел и стрелки вправо или влево на клавиатуре для перемещения по таймфреймам или нажимайте прямо на бар на нужном таймфрейме. Вручную аннотируйте события сжатия и расширения, щелкнув правой кнопкой мыши по нижней панели на нужном таймфрейме.
Посмотрите на кривые выживания в левой части и точечную диаграмму, сравнивающую время прекращения энергичного движения со временем смерти для каждого человека в правой части раскадровки. Чтобы сгенерировать время смерти для эксперимента, в браузере Worm выберите файлы данных, время смерти, а затем нажмите кнопку Создать время смерти для текущего эксперимента. Влияние ручной проверки данных на кривые выживаемости показано ниже.
Первоначальные кривые выживания, созданные до аннотирования раскадровки, были искажены из-за неправильного включения объектов, не являющихся червями. После исключения объектов, не являющихся червями, во время аннотирования раскадровки вручную результирующие кривые выживания показали значительно улучшенное разрешение. Графическое представление демонстрирует предполагаемую среднюю оставшуюся продолжительность жизни на разных этапах анализа после получения изображений и ее корреляцию с продолжительностью жизни червя.
Было обнаружено, что ручное аннотирование времени смерти в поведенческом анализе старения особенно важно для долгоживущих червей. В данном случае это те, кто подвергался воздействию самых низких концентраций быков. В заключение, автоматизированная оценка продолжительности жизни достаточно точна для анализа выживаемости.
В то время как поведенческие тесты на старение могут выиграть от ручной аннотации.
