Выполняйте изоляцию клеток лимбальной ниши, или LNC, работая в стерильных условиях на сверхчистом рабочем столе. Извлеките ткань лимба из промежуточной среды для хранения роговицы. С помощью стерильного хирургического круглого лезвия соскребите и удалите радужную оболочку и эндотелий вокруг роговицы.
Далее стерильным хирургическим круглым лезвием разрежьте ткань лимба на 12 равных частей, оставив всего по одному миллиметру ткани по обе стороны роговицы и склеры. После этого перенесите 12 кусочков ткани лимба на 35-миллиметровую культуральную пластину и добавьте 1 миллилитр коллагеназы А, чтобы полностью погрузить ткани в пластину. Переварите ткани путем инкубации культурального планшета в клеточном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 18 часов.
Разморозьте матрикель или матрицу базальной мембраны в холодильнике, установленном при температуре 4 градуса Цельсия. Подготовьте стерилизованный пакет, содержащий наконечники объемом 200 микролитров и 1 миллилитров, центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и планшет на 6 лунок, и поместите пакет при температуре минус 20 или минус 80 градусов Цельсия на 20 минут. После извлечения наконечников, центрифужной трубки и 6-луночной пластины из охладителя приступайте к выполнению следующих шагов на ультрачистом рабочем столе.
С помощью предварительно охлажденного наконечника объемом 200 микролитров пипеткой наберите 50 микролитров размороженной матрицы базальной мембраны в 1 миллилитр МЭЦМ, и аккуратно перемешайте. С помощью предварительно охлажденного наконечника объемом 1 миллилитров, установленного на пипетке, перенесите полученную матрицу 5%-ной базальной мембраны в одну лунку предварительно охлажденного планшета для культуры на 6 лунок. Осторожно встряхните 6-луночную пластину горизонтально, прежде чем поместить ее в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия примерно на один час, чтобы подготовить культуральную пластину, покрытую 5% матригелями.
После 18-часового переваривания извлеките коллагеназу А из переваренной лимбальной ткани, в основном содержащей небольшие видимые скопления. Работая под стереомикроскопом, используйте наконечник пипетки объемом 200 микролитров, чтобы отделить кластеры от непереваренных тканей склеры. Погрузите отделившиеся кластеры в 0,25% трипсин-ЭДТА в 35-миллиметровую культуральную пластину и инкубируйте планшет в течение 15 минут.
Затем добавьте в тарелку 1 миллилитр MESCM с 10% нокаутной сывороткой, чтобы утолить пищеварение клеток. Аккуратно пипетируйте суспензию вверх и вниз с помощью наконечника для пипетки объемом 1 миллилитров, чтобы разбить кластеры на отдельные клетки. Переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре.
Не нарушая клеточную гранулу, осторожно удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 миллилитр MESCM для ресуспендирования клеток. Используя наконечник для дозатора объемом 1 миллилитров, пипетируйте содержимое вверх и вниз два-три раза, чтобы убедиться, что вся гранула повторно суспендирована в MESCM. Соберите из суспензии 20 микролитров для подсчета клеток.
Далее с помощью пипетки объемом 1 миллилитр перенесите клеточную суспензию на 5% базальную мембранную матрицу, покрытую 6 лунками планшета. Добавьте MESCM, чтобы общий объем в лунке составил 2,5 миллилитров. Аккуратно встряхните 6-луночную пластину горизонтально, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек.
После визуализации клеток перенесите их в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия. Продемонстрированный протокол успешно переварил ткань ободка склеры роговицы, генерируя кластеры, которые можно было визуализировать под микроскопом. Как и ожидалось, гроздья по форме напоминали гусеницу.
Первичные LNC росли медленно и требовали около 12 дней для выращивания. LNC от прохода 1 до 8 прохода понадобилось около трех дней, но темпы роста LNC после прохода 9 значительно снизились. Морфологически ЛНК были веретенообразными и круглыми в проходе 0.
После прохода 3 они были веретенообразными с одинаковыми размерами. Количество удвоений клеток или NCD представляло собой скорость роста LNC. Кривые NCD и аккумулятивные NCD показали, что LNC росли быстрее всего от прохода 3 до прохода 5.
