Чтобы идентифицировать клетки лимбальной ниши или LNC с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, добавьте 1 миллилитр 0,25% трипсина ЭДТА на лунку к LNC, культивируемым в 6-луночном планшете, покрытом 5% матригелем. Переварите клетки, инкубируя пластину в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Утолите пищеварение, добавив в клеточную суспензию 1 миллилитр нокаутной сыворотки, содержащей MESCM.
Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугируйте ее 200G в течение пяти минут, прежде чем осторожно отачивать надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре MESCM. Затем с помощью цитофуга равномерно нанесите 80 микролитров клеточной суспензии на четыре предметных стекла микроскопа в соответствии с инструкцией производителя.
Зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом примерно на 10 минут. Затем проникните клетки на предметные стекла с помощью 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15 минут. Заблокируйте клетки 2%-ным бычьим сывороточным альбумином на один час перед инкубацией их с первичными антителами в шейкере на ночь при температуре 4 градуса Цельсия.
После инкубации удалите несвязанные антитела, промыв предметные стекла PBST три раза по пять минут каждый. Затем инкубируйте образец с подходящими вторичными антителами при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа перед промыванием любых несвязанных антител, как было показано ранее. Противозаправьте ядра DAPI, имеющим концентрацию 5 мкг на миллилитр.
После запечатывания предметных стекол выполните визуализацию с помощью флуоресцентного микроскопа. Используя набор для выделения РНК, извлеките общую РНК из LNC в соответствии с инструкциями производителя. Затем с помощью высокопроизводительного набора для транскрипции комплементарной ДНК или CDNA выполните обратную транскрипцию от 1 до 2 микрограммов РНК.
Приготовьте раствор объемом 20 микролитров, содержащий 2,5 микролитра КДНК, 0,8 микролитра соответствующего генетического праймера, 10 микролитров универсальной мастер-смеси для ПЦР и 6,7 микролитров двойной дистиллированной воды. Затем проводят количественную полимеразную цепную реакцию с использованием соответствующих условий. Наконец, используйте метод сравнительной компьютерной томографии для изучения относительной экспрессии генов.
Двойное иммуноокрашивание LNC четвертого пассажа ясно показало, что эти клетки были последовательно panCK-отрицательными, VIM-положительными, CD90-положительными, CD105-положительными, SCF-положительными и PDGFR-положительными.
