Для начала культивируют ИПСК в поддерживающей среде IPSC на шестилуночном тканевом планшете, покрытом гелем с уменьшенным фактором роста внеклеточным матриксом. Когда температура в клетках достигнет 80-90% v, удалите среду из планшета и промойте ячейки один раз DPBS. Затем добавьте от 700 до 800 микролитров 0,48 миллимоляра ЭДТА и инкубируйте в течение одной минуты при комнатной температуре.
Удалите раствор для сбраживания и инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут. Когда клетки расщепляются в листы, добавьте два миллилитра поддерживающей среды IPSC для прекращения пищеварения. Перенесите суспензию ячеек на шестилуночную пластину с низким уровнем крепления.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и скоростью 60 оборотов в минуту для формирования сферических тел эмбрионов или EB. Через 24 часа, используя прошлую пипетку, перенесите БЭ в центрифужную пробирку и дайте ей отстояться в течение 5-10 минут, прежде чем удалить надосадочную жидкость. Добавьте среду для дифференцировки MSC в пробирку и перенесите EB в шестилуночную лопасть с низким креплением с двумя миллилитрами среды для дифференцировки MSC.
Культивируйте EB на шейкере при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение семи дней. На восьмой день перенесите БЭ в центрифужную пробирку, как было показано ранее. После того, как БЭ осядутся, удалите надосадочную жидкость из трубки.
Добавьте поддерживающую среду MSC в пробирку и перенесите EBs в шестилуночный планшет, покрытый гелем с уменьшенным фактором роста, двумя миллилитрами поддерживающей среды MSC. После адгезии клеток меняйте среду до тех пор, пока культура не достигнет 90% конфлюенции. Затем обработайте культуру, полученную от БЭ, раствором для диссоциации при температуре 37 градусов Цельсия.
Когда часть клеток расщепляется в отдельные клетки, добавьте два миллилитра поддерживающей среды MSC, чтобы завершить разложение, и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку. Один раз промойте оставшиеся непереваренные клетки из лунок с помощью DPBS. И снова переваривайте, как было показано ранее.
Затем центрифугируйте клеточную суспензию при 250г в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и засейте клетки в культуральную пластину, покрытую желатином. Культивируйте клетки в поддерживающей среде МСК до 90% конфлюенции с регулярной сменой среды.
Культура hiIPC линий, как было показано ранее. Когда конфлюенция клеток достигнет от 50 до 60%, удалите поддерживающую среду IPSC из планшета. Добавьте два миллилитра поддерживающей среды MSC.
И культивирование в течение 14 дней при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе с ежедневной сменой среды. Для созревания МСК обработайте монослойную культуру раствором диссоциации при температуре 37 градусов Цельсия. Когда часть клеток расщепляется в отдельные клетки, добавьте в лунки два миллилитра поддерживающей среды MSC для завершения разложения и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку.
Промойте оставшиеся непереваренные клетки один раз с помощью DPBS и переварите их, как показано ранее. Затем центрифугируют клеточную суспензию, как показано ранее, и высаживают клетки на чашку для культуры, покрытую желатином. Культивируйте клетки в поддерживающей среде МСК до 90% конфлюенции с регулярной сменой среды.
В методе формирования EB колонии hiIPC демонстрировали компактную морфологию до дифференцировки. После диссоциации образовывались однородные сферические ЭБ, которые со временем увеличивали объем. Впоследствии БЭ трансформировались в адгезивные монослойные клетки, достигнув 90% конфлюенции к 18-му дню и приобретя веретенообразную морфологию после двух пассажей.
Аналогично, при монослойном методе клетки пролиферировали, образуя многослойные адгезивные клетки. После многократной упаковки клетки созревали в МСК с типичной веретенообразной формой и закрученной колонией. Анализ проточной цитометрии показал, что hiIPC были положительными на CD90 и отрицательными на CD34, CD45, CD105 и CD73.
После дифференцировки hiIPCs, управляющие МСК, экспрессировали CD90, CD73 и CD105, оставаясь отрицательными для CD34 и CD45. Монослойные МСК показали более высокое образование отложений кальция, чем метод EB. Тем не менее, не наблюдалось существенных различий в адипогенных и хондрогенных дифференцировочных способностях.
Пролиферативные способности обоих методов сохранялись на протяжении до 20 проходов.
