Начните с химической модификации объединенных белковых фракций с помощью восстановительного метилирования. Для этого берут очищенный белок и добавляют в него 20 миллимолярного диметиламина борана, а затем 40 миллимолярного формальдегида. Выдержите смесь в осцилляторном вибростенде в течение двух часов при температуре четыре градуса Цельсия.
Затем добавьте в смесь еще 10 миллимоляров диметиламина борана. Затем инкубируйте смесь в течение ночи от 12 до 18 часов при четырех градусах Цельсия. Погасите реакцию, добавив 100 миллимоляров трис хлорида, имеющего pH 7,5.
Используйте соответствующий буфер для промывки и буфер для элюирования для загрузки метилированного белка в колонку с никель-NTA. Сначала промойте двухмиллилитровую никель-NTA колонку с 10 объемами промывочного буфера. А затем разбавьте белок элюирующим буфером.
После элюирования проведите элюат белка через обессоливающую колонну PD-10, предварительно уравновешенную соответствующим буфером. Добавьте к обессоленному белку холестерин, приготовленный в изопропаноле или этаноле, и выдержите смесь в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующее утро ультрацентрифугируйте смесь при 150 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Добавьте собранную надосадочную жидкость в центробежный концентратор с отсечкой 100 килодальтон и сконцентрируйте надосадочную жидкость до конечной концентрации от 30 до 50 миллиграммов на миллилитр. Еще раз центрифугируйте концентрированный белок с помощью высокоскоростной настольной охлаждаемой центрифуги и удалите гранулы. Поместите собранную надосадочную жидкость на лед при температуре четыре градуса Цельсия, прежде чем приступить к кристаллизации.
Алкилированные белки, хранящиеся при четырех градусах Цельсия, были проанализированы с помощью аналитической гель-фильтрационной хроматографии в течение месяца. И он показал небольшую потерю белка через неделю.
