Начните с приготовления 10% раствора бицелла, содержащего липиды и моющее средство. Для этого возьмите предварительно высушенный липид, который представляет собой смесь пяти моль процента холестерина и 95 моль процента DMPC, и добавьте к нему раствор моющего средства CHAPSO в деионизированной воде. С помощью водяной бани соникатера повторно суспендируйте липидную моющую смесь, обрабатывая ее ультразвуком в ледяной воде при непрерывном питании до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
Затем с помощью центробежного фильтра 0,2 микрона удалите все нерастворенные компоненты. Затем, работая со льдом, соедините полученный раствор бицеллярного стока с заранее подготовленным образцом белка в соотношении один к четырем объемам. Инкубируйте белковую бицеллярную смесь на льду в течение 30 минут.
Для кристаллизации в 48-луночном планшете смешивают 0,5 или один микролитр белковой бицеллярной смеси с равным объемом кристаллизационного резервуарного раствора. Затем настройте кристаллизацию в режиме диффузии пара с помощью 48-луночного планшета и инкубируйте кристаллизационную установку при температуре 20 градусов Цельсия. На следующий день проверьте кристаллизационные лотки, чтобы убедиться, что покровное стекло надежно закрыто.
Проверяйте рост кристаллов не реже одного раза в день с помощью настольного стереомикроскопа, оснащенного поляризатором. Наконец, замочите кристаллы белка в 0,2 молярного малате натрия и заморозьте их в криопетлях 50 или 100 микрометров с использованием жидкого азота. Зрелые кристаллы, пригодные для сбора данных, обычно появлялись в течение одной-двух недель и обычно имели размеры 50 микрон на 100 микрон на два микрона.
