Чтобы начать сбор костного мозга, замочите усыпленную крысу в 75%-ном этаноле, чтобы стерилизовать шерсть и кожу. Положите крысу на спину и отрубите нижние конечности в области бедра, чтобы защитить головку бедренной кости. Используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать связку в скакательном суставе.
Затем согните коленный сустав назад, чтобы обнажить бедренную и большеберцовую кости. С помощью щипцов и ножниц осторожно удалите все мышцы, сухожилия и другие ткани, связанные с костями. Проткните костный мозг через оба конца кости 5-миллиметровым шприцем с иглой, чтобы ослабить матрикс костного мозга.
Теперь с помощью свежего шприца промойте костный мозг 10-15 миллилитрами среды RPMI. Центрифугируйте клетки костного мозга при 300G в течение 10 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 5-10 миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов.
После инкубации суспензии добавьте в смесь четырехкратный объем HBSS. Затем центрифугируйте клетки при 600G в течение пяти минут при комнатной температуре. Полученную гранулу используйте для дальнейшего использования.
Сначала изолируйте нейтрофилы с помощью набора для выделения нейтрофилов костного мозга крысы. Нанесите 2 миллилитра реагента 80-55% на столбец в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, чтобы создать градиент плотности. Затем пипетку выделенных нейтрофилов или раствор ресуспензии клеток, выделенных с помощью набора для выделения нейтрофилов костного мозга крысы, в пробирку.
Центрифугируйте пробирку при 800 г в течение 40 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Стерильной пипеткой соберите 70%-ный градиентный слой, включая клеточные слои на границе 65-70%. Переложите клеточную суспензию в новую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.
Добавьте в пробирку 15 миллилитров HBSS и аккуратно переверните, чтобы перемешать ее содержимое. Наконец, центрифугируйте пробирку при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. Для одноступенчатого процесса, после пипетирования суспензии костного мозга непосредственно в трубку с градиентом плотности, центрифуга, как было показано ранее.
Затем пипеткой удалите слой градиента 70%, включая слои на границе градиента 75-70%. Перенесите эту клеточную суспензию в новую 50-миллилитровую центрифужную пробирку с 10 миллилитрами HBSS. Затем центрифугируйте пробирку при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки.
Подсчитайте выделенные нейтрофилы с помощью гемоцитометра и оцените жизнеспособность клеток с помощью окрашивания трипановым синим. Двухступенчатый метод имел повышенный уровень чистоты 90% по сравнению с 50%, достигаемыми одностадийным методом.
