Флуориметрическое количественное определение и цитометрический анализ внеклеточных ловушек (НВЛ) нейтрофилов крыс

Для начала нанесите пипеткой 50 микролитров изолированных образцов NET крыс в пробирку с 450 микролитрами буфера Tris-EDTA. Теперь пипеткой 100 микролитров стандартов ДНК и образцов в 96-луночную пластину. Добавьте в лунки равный объем реагента для анализа.

Затем выдержите планшет при комнатной температуре в течение двух-пяти минут, избегая воздействия прямых солнечных лучей. Поместите планшет во флуоресцентный микропланшетный ридер. Установите спектр излучения около 530 нанометров и спектр поглощения около 480 нанометров.

Инкубируют клетки в одном микролитре красителя ядра в течение 30 минут. Далее инкубируют клетки в одном микролитре бесклеточного штамма ДНК в течение 10 минут. Аккуратно смешайте флуоресцентные красители.

Загрузите планшет с образцом в цитометр. Переключитесь на канал SYTOX Green, затем выберите канал HEXT. Установите освещение на синий 377/447 и отрегулируйте время экспозиции на 300 000 микросекунд.

Нажмите «Настройка фокусировки», а затем нажмите «Зарегистрировать авто», чтобы автоматически настроить фокусировку. Выберите канал SYTOX Green и установите подсветку на Green 483/536. Установите время экспозиции для SYTOX Green на 30 000 микросекунд.

Нажмите «Начать сканирование», чтобы начать процесс сканирования. Сопоставимые ответы в секреции НВЛ были различимы между периферическими нейтрофилами и нейтрофилами костного мозга независимо от стимуляции PMA. Rat NET также продемонстрировали ограниченные возможности кросс-линкинга друг с другом.

Инкубация с PMA привела к увеличению содержания внеклеточной ДНК на 10% через четыре часа, что указывает на более высокую склонность к запуску образования НВЛ.