Экстракция и анализ ДНК из клеточного компонента глазной влаги

Чтобы выполнить экстракцию ДНК, сначала добавьте соответствующее количество раствора лизиса клеток в клеточную гранулу, полученную из влаги глаза. Пипеткой распределите раствор вверх и вниз, чтобы тщательно его перемешать. После того, как клетки будут полностью лизированы, добавьте раствор белкового осадка, чтобы он составил одну треть от общего объема.

Теперь взбейте и энергично перемешайте в течение 20-30 секунд. Затем отжмите его в течение трех минут при 3000г при комнатной температуре. Тем временем перелейте 300 микролитров изопропанола в чистую пробирку для микроцентрифуги.

После завершения центрифугирования осторожно пипетируйте надосадочную жидкость в пробирку, содержащую изопропанол. Затем добавьте в пробирку 1,5 микролитра гликогена и переверните пробирку, чтобы тщательно перемешать. Поместите пробирку при температуре минус 20 градусов Цельсия в морозильную камеру на час или на ночь, чтобы облегчить осаждение ДНК.

После замораживания центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при температуре 3000 г при комнатной температуре. Затем пипеткой извлеките изопропанол. Для промывки гранулы добавьте 0,5 миллилитра 70%-ного этилового спирта.

Осторожно переверните трубку, чтобы обеспечить равномерную стирку. Затем вращайте тюбик в течение одной минуты при температуре 3000 г при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость из центрифужной пробирки.

Теперь переверните трубку на чистую марлю, чтобы слить раствор и высушить гранулу. После быстрого отжима в микроцентрифуге используйте одноразовый наконечник с тонким наконечником, чтобы пропипетировать оставшуюся каплю этанола. Затем добавьте 45 микролитров раствора гидратации ДНК в высушенную гранулу ДНК.

Затем поместите трубку в нагревательный блок, установленный на 50 градусов по Цельсию. Выход ДНК как клеточных, так и внеклеточных компонентов глазных жидкостей был одинаковым. Проведен ПЦР-анализ клеточного и внеклеточного компонентов витреоретинальной лимфомы-ассоциированной мутации.

Более высокая частота мутаций присутствовала в бесклеточном компоненте, о чем свидетельствует пониженный порог цикла.