Экстракция и анализ бесклеточной ДНК из глазного гумора

Для начала добавьте 70 микролитров кондиционирующего буфера на каждый миллилитр бесклеточного супернатного нарушения глазного юмора. Тщательно перемешайте шарики для очистки. Затем добавьте бусины в образец, затем вмешайте смесь образца и бисера.

Центрифугируйте эту смесь при 3000 Г в течение 15 минут при комнатной температуре. Не вытесняя гранулу, извлеките супернат, затем добавьте к грануле равный объем буфера для переваривания гранул мочи. Пипеткой распределите раствор вверх и вниз, чтобы снова взвесить гранулу.

Теперь добавьте протеиназу К в повторно взвешенную гранулярную смесь. Инкубируйте смесь при температуре 55 градусов Цельсия в течение 30 минут, затем добавьте равный объем буфера для лизиса генома в смесь для переваривания. Тщательно перемешайте раствор, чтобы он хорошо перемешался.

Теперь поместите имеющуюся в продаже спиновую колонку в новую сборную пробирку. Добавьте 200 микролитров буфера для подготовки ДНК мочи к спиновой колонке. Центрифугу при 16 000 G в течение одной минуты при комнатной температуре и выбросьте.

Теперь пипеткой 700 мкл мочи ДНК промывают буфером к колонке и центрифуге, как показано на рисунке. После отбраковки проточной колонки перенесите спиновую колонку в микроцентрифужную пробирку без ДНКазы, без РНКазы. Наконец, добавьте соответствующий объем буфера для элюирования ДНК непосредственно в матрицу колонки и оставьте его на три-пять минут при комнатной температуре, а затем снова центрифугируйте для получения бесклеточной ДНК.

Выход ДНК как клеточных, так и внеклеточных компонентов глазных жидкостей был одинаковым. Проведен ПЦР-анализ клеточного и внеклеточного компонентов мутации, ассоциированной с витреоретинальной лимфомой. Более высокая частота мутаций присутствовала во внеклеточном компоненте, о чем свидетельствует пониженный порог цикла.