Диссоциация пигментных эпителиальных клеток сетчатки из эмбриональных стволовых клеток человека и определение оптимальной стадии криоконсервации

Для начала разведите флакон размороженной холодной матрицы базальной мембраны с 12 миллилитрами DM EM F12. Хорошо перемешайте суспензию. Добавьте по одному покровному листу в каждую лунку 24-луночного планшета.

Затем нанесите пипеткой по 250 микролитров раствора разбавленной матрицы в каждую лунку. Выбросьте питательную среду из культивируемых пластин пигментного эпителия сетчатки, полученных из hESC. Вымойте тарелки два раза одним миллилитром предварительно подогретого PBS на лунку.

Далее добавьте 0,5 миллилитра реактива для диссоциации клеток в лунки культуральных планшетов, и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы инициировать пищеварение. После инкубации понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить окончание пищеварения. Теперь с помощью пипетки объемом в один миллилитр аккуратно пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз 10 раз.

Добавьте предварительно подогретую питательную среду для разбавления суспензии. Затем центрифугируйте его при 250 G в течение трех минут при комнатной температуре. Вылейте надосадочную жидкость из пробирки центрифуги.

Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах питательной среды. С помощью пипетки перемешайте элементы от 10 до 15 раз. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточное сетчатое фильтр с плотностью 40 микрометров.

Далее подсчитайте клетки пигментного эпителия сетчатки. Аспирируйте раствор покрытия перед нанесением покрытия. Затем добавьте по одному миллилитру питательной среды в каждую лунку и засейте клетки на покровные листы.

После включения и окрашивания EDU получите изображения пяти случайных полей с помощью флуоресцентного микроскопа. Рассчитайте процент EDU-положительных клеток. Затем постройте соответствующие временные кривые пропорций, чтобы построить кривую роста.

Наконец, определите окно замораживания от экспоненциальной фазы для каждой клеточной линии. Клетки пигментного эпителия сетчатки первоначально утратили свою характерную гексагональную морфологию, но позже восстановили ее в экспоненциальной фазе роста. Когда клетки культивировались в течение дополнительной недели, пролиферация клеток уменьшалась.

Анализ пролиферации EDU подтвердил, что клетки пятого дня P2 демонстрируют более высокую скорость пролиферации, в то время как клетки 11-го дня P2 вступили в фазу замедления.