Сохранение пигментных эпителиальных клеток сетчатки, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, с помощью оптимизированной криоконсервации

Для начала диссоциируйте пигментные эпителиальные клетки сетчатки, полученные из hESC, приготовьте клеточную суспензию, а затем подсчитайте клетки. Теперь центрифугируйте клетки при 250 г в течение трех минут при комнатной температуре. Вылейте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в криоконсервирующую среду.

Далее перелейте один миллилитр клеточной суспензии в 1,2-миллилитровый криогенный флакон. Поместите криогенные флаконы в контейнер для заморозки и заморозьте на ночь при температуре минус 80 градусов Цельсия. Переложите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.

Чтобы разморозить замороженные флаконы, сначала нагрейте питательную среду в металлических шариках, нагретых до 37 градусов Цельсия, предварительно залейте 10 миллилитров подогретой питательной среды в 15-миллилитровую пробирку. Теперь извлеките криогенные флаконы из жидкого азота и поместите их в автоматизированную систему размораживания для быстрого размораживания. Капните в криогенный флакон от 0,5 до 1 миллилитра предварительно подогретой питательной среды, чтобы обеспечить постепенную адаптацию клеток.

Затем пипетируют от 1,5 до двух миллилитров клеточной суспензии в 15-миллилитровую пробирку со средой. Центрифугируйте клетки при 250г в течение трех минут при комнатной температуре. Затем выбросьте надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах теплой среды. Загрузите клетки в гемоцитометр и подсчитайте их, чтобы определить показатели восстановления и выживаемости. Культивируют размороженные клетки на планшетах, покрытых базальной мембраной, в культуральной среде с Y27632.

Клетки пигментного эпителия сетчатки, которые были заморожены на пятый день в экспоненциальной фазе, показали более высокую скорость прикрепления после оттаивания. По сравнению с характерной для них гексагональной морфологией, клетки, замороженные в других временных точках, имели фибробластический фенотип. Клетки Р2 пятого дня показали более высокую экспрессию и более правильно локализованные клеточные маркеры через 28 дней после размораживания.

Было отмечено, что различные среды криоконсервации одинаково хорошо справляются с достижением высокой жизнеспособности клеток и прикрепления после размораживания.