Для начала перед инкубацией смажьте микрочашку 150 микролитрами раствора для прикрепления клеток от 0,01% до 0,1%. После того, как посуда высохнет на воздухе, добавьте 80 микролитров раствора наночастиц золота по каплям на сухую поверхность. На следующий день удалите добавленную питательную среду из микролунки.
Затем добавьте два миллилитра трансфицированных клеток поверх иммобилизованных наночастиц золота на стеклянной поверхности. Инкубируйте тарелку перед началом экспериментов. Используйте конфокальный микроскоп с органным лазером, настроенным на 488 нанометров, чтобы увидеть флуоресценцию GFP от белка аннексина.
Установите гелиево-неоновый лазер на 633 нанометра для наблюдения за отражением наночастиц золота. Выбирайте одиночные клетки, а не клеточные кластеры, чтобы предотвратить перекрытие плазматических мембран. Убедитесь, что иммобилизованные наночастицы золота присутствуют в виде отдельных частиц и находятся на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы предотвратить увеличение теплового градиента.
Используйте оптический пинцет, чтобы облучать наночастицу золота в течение одной секунды, чтобы разрушить плазматическую мембрану. Для получения гигантских одноламеллярных везикул или GUV нанесите 90 микролитров подогретого 5%-го геля ПВА на предметное стекло. Равномерно распределите гель по предметному стеклу.
Затем дайте горке высохнуть в нагревательном шкафу при температуре 50 градусов Цельсия в течение 50 минут. Далее с помощью стеклянного шприца нанести 30 микролитров липидной смеси. Краем иглы распределите смесь в тонкую пленку.
Примените слабую струю газообразного азота, чтобы испарить хлороформ липидной смеси. Затем высушите предметные стекла под вакуумом в течение 1,5-2 часов. В отдельную двухмиллилитровую пробирку добавьте 400 микролитров буфера для выращивания.
Затем добавьте интересующий нас рекомбинантный белок до конечной концентрации 500 наномоляр. Пипетку 400 микролитров разведенного белка в собранную камеру и оберните камеру в PERIFIL. После часовой инкубации перелейте 400 микролитров содержимого камеры в двухмиллилитровую пробирку.
Добавьте один миллилитр наблюдательного буфера в собранный раствор, чтобы удалить все неинкапсулированные белки. Затем центрифугируют раствор при 600 Г в течение 10 минут при 13 градусах Цельсия. Затем замените один миллилитр надосадочной жидкости наблюдательным буфером и осторожно пипеткой, чтобы диспергировать GUV.
Поставьте в холодильник до начала экспериментов. Чтобы проколоть GUV, сначала покройте поверхность 35-миллиметровой стеклянной чашки бета-казеином. Затем добавьте 5 микролитров 150-нанометровых нанооболочек золота в смесь GUV, содержащую хлорид кальция.
Перенесите смесь в камеру и установите ее на столик микроскопа. Используйте оптический пинцет, чтобы захватить индивидуальную золотую нанооболочку на поверхности GUV. Когда захваченная нанооболочка находится в тесном контакте с мембраной GUV, увеличьте мощность лазера, чтобы проколоть целевой участок.
Облучение наночастиц приводило к повреждению мембраны и вызывало быстрое рекрутирование аннексинов в месте повреждения после притока кальция с образованием кольцеобразной структуры. В экспериментах GUV пункция мембраны быстро запечатывалась при отсутствии аннексинов. Уникальные биофизические характеристики белка аннексина А4 привели к разрыву GUV из-за его способности сворачивать мембраны.
Присутствие аннексина в ГУВ вызывало быстрое накопление в месте повреждения после пункции мембраны. Анализ колец аннексина А5 в клеточных экспериментах показал, что они остаются постоянными во времени и пространстве. Разрушение плазматической мембраны с помощью термоплазмоники вызвало повышенный уровень ионов кальция.
Клетки достигли максимальной интенсивности кальция на 6,6 секунде, что, как предполагается, соответствует времени закрытия раны.
