Для начала возьмите 10 миллилитров диатомовой воды в центрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирку при 13, 400 G в течение пяти минут. С помощью пистолета-пипетки аккуратно сбросьте 9,8 миллилитров надосадочной жидкости.
Затем перелейте 200 микролитров образца обогащенной диатомовой воды в двухмиллилитровую центрифужную пробирку. Далее возьмите 0,5 грамма ткани края легких из утонувшего человеческого тела. Ножницами разрежьте легочную ткань до тех пор, пока она не станет мутной.
Для извлечения ДНК из образцов диатомовых водорослей и легких сначала добавьте стеклянные шарики к обоим образцам. Хорошо перемешав образцы, добавьте в пробирки 40 микролитров протеиназы К. После 15-минутной инкубации при комнатной температуре добавьте в обе пробирки по 200 микролитров связующего буфера.
Сразу же перемешайте образцы с помощью вихревого миксера в течение четырех минут. Затем поместите трубки на водяную баню при температуре 70 градусов Цельсия на 10 минут. пока решение не станет ясным.
Далее переведите прозрачный раствор с флокулянтом в осадок. в трехсантиметровую адсорбционную колонну, упакованную кремниевой матрицей. Центрифугируйте колонку при 8 000 G в течение 30 секунд.
Затем слейте отработанную жидкость из сборной трубки и установите колонку обратно в сборную трубку. Теперь добавьте в колонку 500 микролитров буфера для удаления ингибитора и центрифугируйте при 13, 400 G в течение 30 секунд. После удаления отработанной жидкости добавьте 700 микролитров промывочного буфера в колонку и снова центрифугируйте.
После удаления отработанной жидкости поместите адсорбционную колонну обратно в пустую сборную трубку. Центрифугируйте колонку при 14, 500 G в течение двух минут, чтобы удалить как можно больше буфера для промывки. Теперь выньте колонку и поместите ее в чистую центрифужную пробирку.
Добавьте 100 микролитров элюирующего буфера в среднюю часть адсорбционной мембраны. Центрифугируйте колонку при 13, 400 G в течение одной минуты после пятиминутной инкубации при комнатной температуре. Переведите полученный в сборной пробирке раствор обратно в адсорбционную колонну перед повторным центрифугированием.
Храните элюированную ДНК диатомовых водорослей при температуре от двух до восьми градусов Цельсия для использования в будущем. Электрофорез в агарозном геле показал полосы ДНК диатомовых водорослей от 250 до 500 лет назад как в образцах воды, так и в тканях после амплификации ПЦР.
