Для начала в шестилуночный планшет засейте один миллилитр эмбриональных клеток человеческой почки 293T. Добавьте два миллилитра полного DMEM. На следующий день замените среду свежей средой без антибиотиков, чтобы подготовить клетки к трансфекции.
Чтобы трансфектировать адгезивные клетки, сначала приготовьте смесь А, добавив плазмидную ДНК в 100 микролитров Opti-MEM. Далее добавьте 17,5 микролитров полиэтиленимина на 100 микролитров Opti-MEM. Смешайте содержимое смеси А и В, затем инкубируйте.
Во время инкубации осторожно переворачивайте пробирку каждые три-четыре минуты, чтобы улучшить перемешивание. Добавьте весь объем смеси в тарелку с элементами HEK 293T. После 16-20 часов трансфекции замените питательную среду свежей полной ДМЭМ.
Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислого газа, чтобы получить вирусы псевдотипа. Через 72 часа после трансфекции соберите надосадочную жидкость в пробирку для сбора. Центрифугируйте надосадочную жидкость при 1 600 G в течение семи минут при комнатной температуре.
Затем отфильтровать надосадочную жидкость через фильтр из ацетата целлюлозы 0,45 мкм. Распределите 50 микролитров полного DMEM в лунки 96-луночного планшета. Оставьте строку A пустой.
Добавьте 100 микролитров запаса псевдовируса в лунки в ряду А. Затем пипеткой внесите 50 микролитров раствора из ряда А в В. Повторите этот процесс до ряда G для получения последовательных разведений. Удалите отработанную среду из планшета с культивируемыми чувствительными клетками HEK 293T ACE2 и промойте клетки четырьмя миллилитрами DPBS. Затем отделите клетки одним миллилитром трипсина ЭДТА в физрастворе DPBS.
Теперь добавьте по 50 микролитров восприимчивой клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую вирусы псевдотипа. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислым газом в течение 48 часов. Добавьте по 100 микролитров реактива люциферазы в каждую лунку.
После инкубации переложите содержимое каждой лунки в черную 96-луночную пластину. Затем прочитайте табличку в считывателе. В 96-луночный планшет добавьте 50 микролитров свежего полного DMEM в столбцы с первого по 10 из строк B в H. Добавьте 95 микролитров свежего полного DMEM в соответствующие лунки строки A. Теперь добавьте 50 микролитров полного DMEM в лунки в столбец 11 и 100 микролитров DMEM в столбец 12.
Пипеткой направьте пять микролитров термоинактивированных образцов сыворотки в ряд А. С помощью многоканальной пипетки смешайте образцы в первом ряду и перенесите 50 микролитров сыворотки, содержащей среду, содержащую среду, из ряда А в В до ряда Н. Распределите по 50 микролитров разбавленной псевдовируссодержащей среды в каждую лунку с первого по 11-й столбцы. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислым газом в течение одного часа. Приготовьте суспензию восприимчивых к HEK293T ACE2 клеток в пять миллилитров.
Добавьте по 50 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку, затем инкубируйте перед проведением анализа люциферазы. Более низкое разведение сыворотки крови приводило к снижению проникновения вируса в клетки. Это подтверждается повышенным процентом обезвреживания.
