Чтобы выполнить органоидное покрытие, сначала удаляют надосадочную жидкость из центрифуги и промывают клетки гепатоцеллюлярной карциномы. Повторно суспендируйте клетки в 50 микролитрах экстракта базальной мембраны (BME) на лунку для покрытия. Далее приостановите ячейки в продвинутом DMEM/F12.
Затем аккуратно пипетируйте клеточные агрегаты до получения равномерной суспензии. Добавьте BME в суспензию, следя за тем, чтобы концентрация BME составляла от 30 до 50%. Теперь засейте 50 микролитров капель BME с кластерами клеток в центре 24-луночного планшета. Дайте каплям застыть при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.
Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров предварительно подогретой среды и инкубируйте в клеточном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Обновляйте питательную среду каждые два-три дня. Через две недели замените изолирующую среду на органоидную расширительную среду.
После 7-10 дней культивирования, когда органоиды достигнут соответствующей плотности, обрабатывайте культуры по мере необходимости. Чтобы пропустить органоиды, сначала нагрейте в инкубаторе планшеты для культивирования клеток со сверхнизкой поверхностью прикрепления. Затем разморозьте замороженный BME в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия прямо перед использованием.
Подогрейте раствор органоида и заменитель трипсина при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После этапа подготовки удалите питательную среду из органоидной тарелки для культуры. Затем переложите органоидную суспензию в 15 миллилитровую трубку.
Теперь добавьте раствор для сбора органоидов пропорционально количеству BME. Чтобы перемешать суспензию, используйте пистолет-пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы соскоблить и провести пипеткой вверх и вниз. После инкубации пробирки при комнатной температуре в течение 30 минут с помощью пипетки объемом в один миллилитр осторожно отсасывайте ВМЭ.
Убедитесь, что БМЭ полностью растворен. Контролируйте экстракт каждые 10 минут, пока не станет видно прозрачное скопление органоидных клеток. Затем центрифугировать при комнатной температуре при 400 г в течение пяти минут.
Удалите как можно больше надосадочной жидкости. Чтобы начать ферментативное расщепление органоидов гепатоцеллюлярной карциномы, добавьте от одного до пяти миллилитров предварительно подогретого заменителя трипсина в культивируемую органоидную гранулу. Выдерживайте суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут.
Используйте микроскоп, чтобы проверить, диссоциируют ли органоиды на небольшие кластеры от двух до 10 клеток. Чтобы остановить пищеварение, добавьте соответствующий объем холодной базальной среды. Затем центрифугируйте органоиды при 400 г в течение пяти минут при восьми градусах Цельсия.
Осторожно удалите как можно больше надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте нужное количество органоидов в подходящей матрице для нанесения покрытия. Каждые 10 дней проходят прохождения органоидов, в зависимости от плотности роста органоидов.
Сфероиды органоидов ГЦК наблюдались в течение трех дней после культивирования. Компактные сфероиды с закругленными краями и проницаемым цитозолем были замечены в первый день укоренения. Органоиды имели одинаковый размер и наибольший диаметр при культивировании в 30-50% BME.
БМЭ был наиболее фрагментирован на 10%, что привело к образованию мельчайших органоидов. БМЭ был наиболее неповрежденным на 100%, но в результате получался органоид с промежуточным диаметром. Пролиферирующий органоид HCC достиг размера, превышающего 500 микрометров в каждой культуре через три поколения.
Органоиды ГЦК значительного размера размером более 1000 микрометров были получены в течение 20-дневного периода культивирования.
