Диссоциация ткани гепатоцеллюлярной карциномы для культуры органоидов

Чтобы начать диссоциацию ткани, соберите один-два кубических сантиметра ткани гепатоцеллюлярной карциномы или HTC у пациентов, не получавших лечения. Затем поместите ткань в раствор для консервации тканей и поддерживайте его при температуре четыре градуса Цельсия до обработки. Теперь разогрейте планшеты для культивирования клеток со сверхнизким уровнем прикрепления в течение одного часа в инкубаторе, установленном при температуре 37 градусов Цельсия.

Разморозьте экстракт базальной мембраны на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. С помощью хирургических ножниц разрежьте опухолевую ткань на мелкие кусочки на чашке Петри внутри ламинарного проточного колпака. Переложите эти кусочки в 15-миллилитровую коническую трубку и добавьте от пяти до 10 миллилитров базальной среды.

С помощью баротропной пипетки смойте как можно больше крови. Дайте смеси отстояться в течение одной-двух минут, прежде чем удалить часть надосадочной жидкости, включая любые клетки крови и плавающие жировые сгустки. Далее центрифугируйте смесь при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем осторожно извлеките надосадочную жидкость и добавьте в обрезанную ткань пять миллилитров предварительно подогретого раствора для варежения. Поместите трубку с температурой 37 градусов Цельсия в ротор для оптимального пищеварения. После 30 минут первоначального пищеварения используйте микроскоп для поиска мелких клеточных кластеров.

Чтобы остановить пищеварение, добавьте в трубку пять миллилитров холодной базальной среды. Затем с помощью 100-микрометрового фильтра просейте в новую 50-миллилитровую трубку. Заполните трубку холодной базальной средой, чтобы достичь общего объема в 50 миллилитров.

Затем центрифугируйте клетки при двух G в течение 10 минут при восьми градусах Цельсия. По завершении осторожно удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 50 миллилитрах холодной базальной среды для получения клеточной гранулы для органоидного покрытия.