Для начала используйте шприц Hamilton объемом 25 микролитров для внутрибрюшинного введения 15 микролитров Addgene для обезболивающих крыс. Затем сбрейте шерсть и усы щенков в возрасте от шести до восьми недель, находящихся под наркозом. Установите крысу на стереотаксическую раму с ушными планками.
И подложите под него грелку, чтобы поддерживать температуру тела животного. Далее место марли смачивают в ледяном солевом растворе на голове крысы, чтобы свести к минимуму кровотечение. Скальпелем 15-го размера сделайте надрез по средней линии кожи и мышцы над черепом.
Потяните за кожу и мышцы, чтобы обнажить череп. Сверлом один на четыре круга осторожно проколите черепную крышку, чтобы обнажить передний мозг. Затем с помощью ронжеров прорубите череп.
Скальпелем 15-го размера сделайте надрез в головном мозге и обонятельной луковице. С помощью шпателя аккуратно отсоедините твердую мозговую оболочку от черепа. Затем осторожно приподнимите отрубленный мозг, чтобы показать тройничный ганглий и основание черепа.
Любое кровотечение прижигайте ручкой для прижигания. Чтобы получить изображение GCaMP6-X, поместите полость черепа под объектив микроскопа. Затем сфокусируйте концевой ганглий.
Далее приложите механические раздражители к одному квадратному сантиметру лица. Используйте объектив 20X, чтобы визуализировать нейроны тройничного ганглия, которые реагируют на стимул. Чтобы собрать флуоресцентный стато с течением времени с помощью программного обеспечения для сбора, нажмите кнопку захвата потока в меню сбора.
Затем установите количество кадров на 300 и время сбора данных на 90 секунд. Задайте параметры камеры для получения изображений с частотой кадров. Получение стабильных базовых записей в течение трех минут.
Больший объем титра вируса приводил к усилению нейрональной инфекции детенышей крыс. Легкая механическая стимуляция активировала только область V2 тройничного ганглия. Флуоресценция в состоянии покоя была относительно низкой в большинстве нейронов с небольшими спонтанными увеличениями.
Естественные стимулы, в частности, точечная стимуляция, вызывали наиболее устойчивые нейронные реакции. Стимулы щеткой в моделях хронической травмы сужения вызывали двукратное увеличение величины пиковой реакции у пострадавшего по сравнению с контралатеральной стороной. Когда два стимула применялись последовательно, наблюдалось значительное усиление в ответ на второй стимул.
