Для начала изолируйте левое предсердие и легочные вены или ПВ от сердца мыши. Поместите изолированную ткань в криомолд основанием сердца и верхушкой легкого вверх. Раскручивайте и распутывайте фотоэлектрические панели, если они запутаны.
Затем заполните криомолд соединением ОКТ. С помощью тонких щипцов мягко сжимайте фотоэлектрические плиты, не перемещая их, чтобы удалить остатки воздуха. Заморозьте ткань в составе ОКТ на сухом льду.
Для иммуноокрашивания разморозьте замороженные предметные стекла мыши на системе окрашивания в течение 20 минут. Затем нанесите несколько капель 4% параформальдегидфиксирующего раствора на участки, чтобы закрепить ткань на предметном стекле. После инкубации переместите предметные стекла на вертикальный стеллаж и погрузите их в контейнер, наполненный PBS.
Поставьте емкость на медленный шейкер на пять минут, чтобы промыть горки. С помощью блокирующей жидкости ручки, содержащей ксилол, обведите каждый раздел на каждом слайде. И переставляем слайды на системе окрашивания.
С помощью пастеровской пипетки нанесите одну или две капли раствора для пермеабилизации на каждый образец. Затем очистите раствор Triton X-100, промыв предметные стекла в течение пяти минут в PBS. После перестановки слайдов на системе окрашивания добавьте одну или две капли блокирующего буфера на каждую секцию, обеспечивая полное покрытие.
Далее приготовьте один миллилитр первичной смеси антител, состоящей из первичных антител и блокирующего буфера. Выбросьте остатки блокирующего буфера со слайда. Введите две или три капли первичной смеси антител в каждую секцию.
После инкубации поместите предметные стекла в вертикальную решетку и промойте их в течение пяти минут в буфере для стирки, сохраняя при этом мягкое перемешивание. Затем приготовьте один миллилитр смеси вторичных антител, состоящей из вторичных антител и промывочного буфера. Переместите предметные стекла на систему окрашивания и с помощью пипетки нанесите две или три капли вторичной смеси антител на каждый участок.
Затем очистите стекла три раза по пять минут каждый в буфере для стирки во время встряхивания. Затем добавьте две или три капли раствора Hoechst 33342 в каждую секцию, расположенную на системе окрашивания. Поместите слайды на вертикальную решетку и прополощите их в течение пяти минут в буфере для стирки с легким помешиванием.
Добавьте одну или две капли флуоресцентного монтажного материала на каждую задвижку и запечатайте слайды покровными стеклами. Область отверстия легочной вены в левом предсердии и соединение легочной вены, внелегочные вены и межлегочные вены наблюдались при 10-кратном увеличении. Специфические сигналы cTnT с типичным мышечным бороздом в устье легочной вены, внелегочных венах и внутрилегочных венах наблюдались при 40-кратном увеличении.
Cx43 был обнаружен во всех трех легочных областях и в первую очередь проецировался между соседними кардиомиоцитами. Сигналы, связанные с Cx43, наблюдались на полярной и боковой стороне кардиомиоцитов в рукавах миокарда.
