Скрининг лекарственных средств с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) и препарата клеточного лизата для секвенирования мРНК

Для начала разморозьте криофлакон PBMC на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех минут, осторожно переворачивая его. Затем переложите размороженные клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Промойте криограду одним миллилитром теплой питательной среды и добавьте раствор по каплям в клетки в конической пробирке, чтобы выполнить первый этап разведения.

Теперь центрифугируйте клеточную суспензию в течение пяти минут и плавно наклоните коническую трубку, чтобы удалить надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в трех миллилитрах теплой питательной среды. Для подсчета клеток смешайте 10 микролитров клеточной суспензии с трипановым синим.

Подсчитайте количество клеток, используя 10 микролитров окрашенного клеточного раствора, либо с помощью автоматического счетчика клеток, либо с помощью клеточной камеры. Используйте теплую питательную среду для разбавления клеток до достижения конечной концентрации от 10 до шестых клеток на миллилитр. Затем высевают 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета для клеточных культур.

Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров двухкратного разведения препарата. Чтобы собрать клетки, центрифугируйте планшет с клеточной культурой в течение 10 минут. Используйте вакуумный насос для удаления надосадочной жидкости, поместив наконечник насоса в нижний угол лунки для удержания клеток.

Теперь добавьте в каждую лунку по 200 микролитров ледяного PBS. После центрифугирования планшета в течение пяти минут извлеките надосадочную жидкость. Затем добавьте в каждую лунку по 15 микролитров лизисного буфера.

Используя клейкую герметизирующую пленку, запечатайте пластину для защиты от загрязнения. Вкрутите пластину и центрифугируйте ее в течение одной минуты. Наконец, соберите шесть микролитров раствора лизированных клеток в ПЦР-планшет.