Подготовка всей монтировки и конфокальная визуализация передней области глазного хрусталика мыши для структурного, развивающего и функционального понимания

Начинают процедуру с создания иммобилизационных выпадов в агарозе. Для этого нагрейте и смешайте 2%-ную агарозу с PBS, используя микроволновую печь, до тех пор, пока раствор не станет жидким. Пипеткой 250 микролитров жидкой агарозы в чашку со стеклянным дном.

И, используя гибкую пластиковую крышку, разровняйте агарозу по всему блюду. Как только агароза остынет и полностью затвердеет, используйте щипцы с тонким наконечником, чтобы снять покровное покрытие. Затем с помощью трехмиллиметрового биопсийного пуансона создайте отверстие в агарозе в центре чашки.

С помощью деликатного протирания удалите излишки агарозы. Храните агарозную форму, гидратированную PBS, при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Перед установкой изолированной зеркальной окулярной линзы добавьте два миллилитра соответствующей среды в подготовленную агарозную форму, в зависимости от типа линзы.

С помощью эмбриональных щипцов осторожно перенесите неподвижный или живой хрусталик в углубление в агарозе. Затем поместите чашку на перевернутый столик микроскопа. Убедитесь, что хрусталик расположен передней областью, обращенной к объекту, визуализируя окрашивание ядер.

Если ядра не наблюдаются, используйте изогнутые щипцы, чтобы осторожно повернуть хрусталик примерно на 180 градусов так, чтобы передняя область была обращена к объективу. Далее приступают к получению изображений с помощью конфокального микроскопа. Для визуализации капсул хрусталика можно получить изображения Z-стека с помощью 40-кратного объектива с шагом 0,3 микрона.

Первое изображение получают до поверхности капсулы хрусталика, на что указывает окрашивание WGA, а последнее изображение после апикальной поверхности эпителиальных клеток. Чтобы визуализировать эпителиальные клетки, получите изображения Z-стека с помощью 63-кратного объектива с размером шага 0,3 микрона.