Экваториальная область линзы глаза мыши, подготовка всего крепления и конфокальная визуализация для понимания структурно-развивающей взаимосвязи хрусталика

Начинайте всю подготовку крепления неподвижной линзы с создания иммобилизационных агарозных клиньев. Для этого возьмите посуду со стеклянным дном и налейте в нее около пяти-шести миллилитров расплавленной 2%-ной агарозы. Подождите, пока агароза застынет.

Затем острым лезвием создайте треугольную выемку в затвердевшей агарозе. Достаньте дольку агарозы, и добавьте в блюдо один миллилитр PBS. Аспирируйте остатки агарозы, оставшиеся после срезания.

При необходимости можно создать несколько клиньев в одной чашке, чтобы вместить несколько линз. Чтобы хранить форму, добавьте в нее один миллилитр PBS, прежде чем держать ее при температуре четыре градуса по Цельсию. С помощью изогнутого пинцета поместите линзу в агарозный клин, содержащий один миллилитр PBS.

Отрегулируйте линзу так, чтобы экваториальная область была обращена вниз на стекло микроскопа при размещении над конфокальным объективом. Поставьте чашку на столик микроскопа. Чтобы убедиться, что экваториальная область находится в фокусе, визуализируйте ядра, убедившись, что они выровнены по рядам.

Кроме того, проверьте клетки экваториального эпителия неправильной формы, а также точно выровненные клетки меридионального ряда гексагональной формы, на что указывает окрашивание F-актином на клеточных мембранах. Случайная упаковка ядер в поле зрения указывает на то, что хрусталик обращен кпереди к объективу. Если ядра не наблюдаются, это, скорее всего, указывает на то, что задняя сторона хрусталика обращена к объекту.

В таких случаях используйте изогнутый пинцет для вращения хрусталика до тех пор, пока не будут наблюдаться точно выровненные ядра на экваторе хрусталика.