Выделение одиночных клеток из биопсии верхних отделов эндоскопии, полученных у пациентов желудка, для получения органоидов

Чтобы начать выделение единичных клеток из биоптатов желудка, собранных во время верхней эндоскопии пациента, сначала дайте ткани осесть на дне 15-миллилитровой конической трубки. После осаждения используйте пипетку для аспирации среды и дважды промойте биопсию одним миллилитром PBS с добавлением антибиотика. Перенесите минимум 20 миллиграммов ткани в 1,5-миллилитровый пробирку, содержащий один миллилитр PBS с добавлением DTT.

Используйте тонкие ножницы для препарирования, чтобы разрезать ткань на кусочки размером от одного до двух миллиметров или меньше. Используйте настольную мини-центрифугу в течение 15 секунд, чтобы собрать кусочки ткани на дне пробирки, затем аспирируйте как можно больше надосадочной жидкости. Добавьте пять миллилитров свежеподогретого пищеварительного буфера в 50-миллилитровую коническую пробирку.

Перелейте 500 микролитров буфера из этой пробирки в 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую кусочки ткани. Затем ножницами отрежьте наконечник пипетки объемом 1 000 микролитров снизу, чтобы увеличить диаметр наконечника и свести к минимуму потерю ткани. Теперь с помощью модифицированного наконечника пипетки перенесите небольшие кусочки ткани из 1,5-миллилитровой пробирки в буфер для пищеварения в 50-миллилитровой пробирке.

Инкубируйте пищеварительный буфер и смесь тканей при температуре 37 градусов в течение 30 минут с орбитальным встряхиванием при 200 об/мин. Затем добавьте пять миллилитров подогретого трипсина с 0,25% ЭДТА в ткань в пищеварительном буфере и инкубируйте. Нейтрализуйте буфер пищеварения и трипсин, добавив равный объем усовершенствованной среды DMEM/F-12 и пропустите суспензию через 70-микронный клеточный фильтр.