После того, как полученные от пациента желудочные органоиды готовы к упаковке, приступают к рутинному прохождению органоидов. Во-первых, удалите из каждой лунки среду, содержащую органоиды, встроенные в матрицу базальной мембраны, выполненную в 24-луночном планшете. Затем выдавите один миллилитр ледяного передового фильтрующего материала DMEM F12 непосредственно на матричный купол базовой мембраны.
Продолжайте аспирировать и дозировать среду до тех пор, пока все фрагменты купола не отделятся от пластины. Затем транспортируйте как среду, так и фрагментированную матрицу базальной мембраны из скважины в следующую скважину и повторите процесс для всех скважин, предназначенных для упаковки. После разборки последнего матричного купола мембраны основания распределите среду и смесь в пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Прикрепите наконечник объемом 1000 микролитров к пипетке P1000, а затем вставьте этот наконечник в наконечник объемом 200 микролитров. Используя эту установку пипетки, энергично пропипетируйте смесь органоидной матрицы вверх и вниз, примерно 25 раз, чтобы фрагментировать органоиды на мелкие кусочки. Центрифугируют фрагментированную органоидную смесь, используя настольную центрифугу при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 секунд при 2000 G. С помощью пипетки аспирируют среду и мембрану базальной мембраны матрицы надосадочной жидкости.
Добавьте рассчитанный объем матрицы свежей базальной мембраны к гранулированным органоидам в пробирке. Аккуратно пипеткой распределите содержимое пробирки вверх и вниз, чтобы перемешать. Быстро аликвотная смесь 50 микролитров органоидного матрикса в отдельные лунки 24-луночного планшета.
Немедленно накройте тарелку и одним плавным движением переверните тарелку вверх дном. Поместите перевернутую пластину в инкубатор для культуры тканей с температурой 37 градусов Цельсия на 35 минут, чтобы матрица базальной мембраны полимеризовалась. Наконец, добавьте в каждую лунку 500 микролитров предварительно подогретой желудочной органоидной среды.
К 20-му дню после инициации органоиды были готовы к прохождению, на что указывал большой размер органоида или затемненная внутренняя часть. Органоиды, оставшиеся выходить за пределы этих точек, начали распадаться на 2D монослои. После упаковки и повторного посева желудка купола содержали множество фрагментов органоидов, которые очень быстро реорганизовались во множество других органоидов.
