Промойте вышеуказанные обработанные клетки ледяным PBS, чтобы удалить остатки среды, и добавьте 50 микролитров лизисного буфера RIPA, содержащего PMSF, для лизиса клеток. Соберите клетки в пробирку. Инкубируйте клетки на льду в течение нескольких минут, чтобы обеспечить полный лизис, затем центрифугируйте при температуре четыре градуса Цельсия при 12 000 г в течение 15 минут.
Затем смешайте клеточный лизат с загрузочным буфером и нагрейте смесь при температуре от 95 до 100 градусов Цельсия в течение 5-10 минут на водяной бане, чтобы денатурировать белки. Загрузите 10 микролитров общего белка из каждого образца в гель SDS0-PAGE. Запустите гель под постоянным напряжением 80 вольт.
Прекратите электрофорез, когда бромфеноловый синий достигнет дна разделительного геля. Затем используйте систему влажного переноса на ледяной бане для переноса отделенных белков из геля на мембрану из поливинилидендифторида. После завершения переноса снимите мембрану и инкубируйте мембрану в блокирующем буфере при комнатной температуре около одного часа.
Инкубируют мембрану со вторичным антителом, конъюгированным с HRP. Визуализируйте белковые полосы на мембране с помощью хемилюминесцентной подложки и улавливайте сигнал с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Вестерн-блоттинг-анализ показал, что подавленная экспрессия FAM83A увеличивала белки Bax и расщепленной каспазы-3, снижала экспрессию BCL-2 и увеличивала высвобождение цитохрома С.
