Для начала возьмем парафиновые срезы мозга PFF, введенные C57 черной шестерке мышей. Очистите предметные стекла от воска, окунув их в заменитель ксилола и инкубируя в течение двух минут. Для регидратации опустите предметные стекла в 100% 95% и 70% этанол, а затем два раза в деионизированную воду.
Переложите образцы в контейнер для микроволновой печи вместе с двойной дистиллированной водой. Нагрейте 100-кратный цитратный буфер с pH 6 при четырех градусах Цельсия. Затем приготовьте 350 миллилитров свежего цитратного буфера.
Подготовленный цитратный буфер перелейте в пластиковую емкость с крышкой. Поместите предметные стекла в контейнер с цитратным буфером и закройте крышкой. Разогрейте образцы в микроволновой печи мощностью 700 Вт в течение четырех минут, а затем дайте время для пятиминутного отдыха.
Разогрейте в микроволновой печи еще 1,5 минуты, после чего последует пятиминутный период отдыха и пополните цитратный буфер. Поставьте в микроволновую печь на 1,5 минуты и дайте отдохнуть пять минут. Затем охладите образцы и буфер цитрата на льду в течение 20 минут и промойте их двойной дистиллированной водой.
Высушите образцы предметных стекол с помощью бумажного полотенца, не касаясь ткани. С помощью ручки нарисуйте прямоугольники вокруг кусочков ткани. Теперь перенесите все слайды в коробку для невосприимчивого к окрашиванию слайдов.
Аккуратно промойте их несколько раз с помощью TBS-T, чтобы капли TBS-T оставались в прямоугольниках ручки PAP. Коснитесь слайдов на бумажном полотенце, чтобы удалить TBS-T. Добавьте по 50 микролитров блокировки в каждый прямоугольник и выдерживайте в течение часа при комнатной температуре.
По окончании инкубации с помощью бумажного полотенца удалите блокирующий раствор из образцов. Аккуратно нанесите пипеткой 50 микролитров первичной смеси антител и TBS-T в каждый прямоугольник и инкубируйте образцы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Затем вымойте горки с помощью TBS-T.
Извлеките TBS-T, постучав по бумажному полотенцу. Повторите этот процесс три раза. Затем добавьте 50 микролитров смеси вторичных антител в разведении один к 1000 в TBS-T в каждый прямоугольник и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа в темноте.
После этого промойте образец три раза с помощью TBS-T. Затем инкубируйте образец с DAPI в концентрации два микрограмма на миллилитр в TBS-T в течение одной минуты. Удалите раствор DAPI, постучав по бумажному полотенцу, и трижды вымойте с помощью TBS-T.
Чтобы закрепить стеклозащитное стекло, добавьте к образцам по две капли на предметное стекло монтажного реактива. Осторожно нажмите на крышку, чтобы удалить пузырьки, и дайте образцам высохнуть в течение часа при комнатной температуре. Визуализируйте не менее 50 клеток в различных областях с помощью системы флуоресцентной визуализации со структурированным освещением, оснащенной объективом с 60-кратным маслом или конфокальной технологией.
Чтобы проанализировать клетки, изолируйте интересующую область, нарисовав контур вокруг положительной или отрицательной клетки и используя функцию обрезки. Затем активируйте дескрипторы формы и ограничьте пороговые параметры в заданной функции измерения. Отрегулируйте пороговый уровень, выбрав функцию порога в меню настройки.
Наконец, используйте инструмент анализа частиц и установите подходящий размер для захвата митохондрий. Например, установите размер на 25 бесконечности, затем активируйте пиксельные единицы и выберите показать маски"Показаны существенные nigra pars compacta инъекционных мышей PFF, окрашенных на тирозингидроксилазу VDAC1, PS129, альфа-синуклеин и DAPI. Окрашивание альфа-синуклеином против PS129 позволило отличить клетки, содержащие поражения PS129, от здоровых клеток.
Анализ изображений окрашивания VDAC1 тирозингидроксилазных позитивных нейронов выявил снижение как количества митохондрий, так и соотношения сторон между нейронами, несущими поражения PS129, и нейронами, в которых их не хватает.
