Для начала добавьте 0,25% раствор трипсина-ЭДТА в клетки HeLa и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех минут. Аккуратно диссоциируйте клетки с помощью пипетирования и засейте их в новые планшеты в соотношении один к четырем для прохождения клеток. Чтобы трансфектировать плазмиду в клетки HeLa, смешайте один микрограмм валидированной плазмиды sgRNA PX458 с 50 микролитрами восстановленной сывороточной среды в пробирке A.In пробирке В, осторожно смешайте два микролитра реагента для трансфекции и 50 микролитров восстановленной сывороточной среды и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем соедините содержимое из пробирок А и В и выдерживайте при комнатной температуре еще пять минут. Добавьте смесь в 12-луночный планшет и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести часов. По окончании инкубации замените среду свежей средой DMEM.
Через 24 или 48 часов оцените эффективность трансфекции, исследуя клетки HeLa под флуоресцентным микроскопом. Полностью диссоциируйте трансфицированные клетки HeLa с использованием 0,25% трипсина ЭДТА и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут. Далее подсчитайте ячейки с помощью камеры Нейбауэра или автоматического счетчика клеток.
Поместите клетки в три отдельных 96-луночных планшета для каждой трансфицированной популяции в соответствии с методами серийного разведения. Верните клетки в увлажненный инкубатор на одну-две недели. Для скрининга на основе фенотипа и валидации нокаута CENP-E происходит диссоциация и расширение клеток в 24-луночных или 12-луночных планшетах в течение пяти-семи дней.
Скрининг мутантных клеток с меньшим диаметром колонии с помощью инвертированного микроскопа с линзами объектива с 10-кратным и 20-кратным увеличением. Затем соберите клетки для экстракции ДНК с помощью набора Column Animal Genomic DNA Extraction Kit, следуя инструкциям производителя, и настройте полимеразную цепную реакцию. Лигируйте целевую ДНК в вектор pMD18-T в соответствии с протоколами производителя.
Трансфектируйте лигированную плазмиду в компетентные клетки DH5-Alpha и приступайте к отбору клонов с помощью культуры. Чтобы определить типы нокаута CENP-E, выделите плазмидную ДНК с помощью набора для экстракции плазмид в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проведите секвенирование по Сэнгеру плазмидной ДНК каждой колонии с использованием прямого и обратного праймеров M13.
Семена дикого типа и мутантные клетки HeLa CENP-E на 12-миллиметровой стеклянной крышке помещаются в 24-луночный планшет. Удалите всю среду DMEM и зафиксируйте клетки с помощью 4% параформальдегида и раствора PBS при комнатной температуре в течение 10 минут. Далее окрашиваем ядра DAPI при комнатной температуре в течение пяти минут.
Наблюдайте и валидируйте мутантные клетки CENP-E на основе фенотипа выравнивания хромосом с помощью флуоресцентного микроскопа. Фенотипический скрининг колоний показал, что клетки CENP-E Knockout показали повышенное смещение хромосом по сравнению с контрольной группой.
