Для начала приготовьте 2X-буфер для ОТ-кПЦР в воде, свободной от ДНКазы/РНКазы. Храните буфер при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Далее смешайте праймеры и щупы в тубе объемом 1,5 миллилитров.
Восполните объем с помощью буфера элюирования. Затем храните тюбик при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Приготовьте смесь ферментов с Taq-полимеразой и M-MLV RT в тубе объемом 1,5 миллилитра на льду.
Заполните объем с помощью буфера для хранения Taq-полимеразы. Теперь повторно суспендируйте вирусные синтетические РНК в отдельных пробирках со 100 микролитрами буфера Tris-EDTA, чтобы получить запасы от 10 до шестой копии РНК на микролитр. Чтобы смешать запасы вируса, добавьте по пять микролитров SARS-CoV-2 гриппа А и В к 50 микролитрам буфера Tris-EDTA.
Аналогичным образом смешайте SARS-CoV-2 и MERS-CoV, чтобы получить вторую вирусную смесь. Разведите обе смеси в десять раз, чтобы получить итоговое разведение 10 копий РНК на микролитр. В каждую лунку 96-луночного планшета пипетка 2X буфера, праймера, фермента, свободной от ДНКазы/РНКазы воды и соответствующих смесей РНК.
Запечатайте пластину клейкой пломбой. Затем центрифугируйте пластину в течение одной минуты, чтобы собрать жидкость на дне скважины. Затем запрограммируйте ПЦР-машину на прием быстрого типа блока на 96 лунок с экспериментальным типом, установленным на стандартную кривую.
Установите реагенты на реагенты TaqMan и выберите стандартные свойства прогона. Определите гены-мишени и репортерный краситель. Затем определите имена образцов для каждой тестируемой реакции и назначьте цели и образцы на схеме расположения планшетов.
Теперь введите программу цикла в прибор. Перенесите планшет в машину для количественной ПЦР в режиме реального времени в правильной ориентации и нажмите кнопку для запуска цикла. Выберите расположение файла для сохранения экспериментальных данных.
Затем изучите графики амплификации, предоставленные программой количественной ПЦР. Два разработанных набора смогли успешно амплифицировать все три гена-мишени одновременно с 10 копиями РНК за реакцию. Эффективность амплификации для всех вирусных титрований была выше 99%
