Для начала разморозьте все реагенты, входящие в набор для ПЦР в реальном времени, при комнатной температуре. После оттаивания пульсируйте компоненты вихрем в течение 10 секунд с умеренной скоростью, чтобы смешать их. Затем центрифугируйте при 8 000G в течение 10 секунд при комнатной температуре.
Храните размороженные компоненты на охлаждающем блоке. Затем приготовьте ПЦР-смесь для положительного образца HBV, пяти стандартов HBV и без контроля шаблонов. Тщательно перемешайте добавленные реагенты, осторожно пипетируя от семи до 10 раз, с последующим импульсным вихревым движением, и центрифугируйте при температуре 8 000 G в течение 10 секунд при комнатной температуре.
Затем пипеткой нанесите 15 микролитров ПЦР-смеси в каждую ПЦР-пробирку. Добавьте 15 микролитров экстрагированного образца ДНК, пять стандартов HBV и воду без нуклеазы в качестве контроля без шаблонов. Закройте пробирки для ПЦР и кратковременно вращайте в центрифуге.
Загрузите ПЦР-пробирки в ПЦР-машину в режиме реального времени. Теперь запустите программное обеспечение термоамплификатора. Выберите флуоресцентные красители и запрограммируйте термоамплификатор на ПЦР в реальном времени.
После прогона проанализируйте график усиления с помощью линейной шкалы. Установите порог реакции ПЦР в экспоненциальной фазе. Поддерживайте согласованность пороговых значений для обеспечения точности и воспроизводимости.
Используйте один и тот же порог для всех образцов на конкретном ПЦР-аппарате. Рассматривайте образцы с амплификацией до значения CD 38 как положительные на основе порогового значения анализа. Использовать пять стандартов количественного определения ДНК, специфичной для ВГВ, откалиброванных в соответствии с четвертым международным стандартом ВОЗ по ДНК ВГВ.
Сгенерируйте стандартную кривую с помощью этих стандартов для количественного определения ДНК HBV в неизвестных образцах. Интерпретируйте значения для неизвестных образцов только в том случае, если стандартный наклон кривой находится в диапазоне от минус 3,1 до минус 3,6, квадратичное значение R находится в диапазоне от 0,99 до 1,0, эффективность ПЦР находится в пределах от 90% до 110% и амплификация в отрицательном контроле отсутствует.
