Визуализация митохондрий для понимания их поведения в ответ на изоформ-специфичную модуляцию RAR

Начните с нанесения покрытия SHSY 5Y ячеек в стеклянные донные ячеистые чаши с плотностью 15 на 10 лучей с мощностью четыре ячейки на миллилитр. Обрабатывайте клетки полностью транс-ретиноевой кислотой в культуральной среде, содержащей 1% FBS, в течение пяти дней, а затем обработайте нейротрофическим фактором мозга в течение двух дней. Затем промойте клетки стерильным PBS.

Обрабатывайте клетки в течение 72 часов 10-7 молярами РА или изоформными агонистами с использованием равных частей MEM и среды F12 в сочетании с 1% FBS. Замените среду свежей 1%-ной FBS, содержащей питательную среду, смешанную с 20 наномолярами TMRM в течение 45 минут. Поместите клетки в инкубатор, подключенный к лазерному сканирующему конфокальному микроскопу с температурой 37 градусов Цельсия.

Делайте снимки с помощью 63-кратного масляного иммерсионного апохроматического объектива. Установите размер изображения 512 на 512 пикселей с отверстием в одну единицу площади. Соберите временной ряд из 15 кадров из пяти различных полей зрения в каждой клеточной пластине и стек Z из восьми равноудаленных Z-плоскостей.

Результирующий файл LSM должен содержать данные о времени, положении и Z-стеке.