Для начала высевают 200 микролитров объемом 10 000 клеток гепатоцеллюлярной карциномы в 96-луночный планшет с DMEM и 10% FBS. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе при 5% углекислого газа. На следующий день замените питательную среду и обработайте клетки различными концентрациями перекиси водорода и менадиона.
Растворите пять миллиграммов ДГЭ в одном миллилитре ДМСО. Для рабочего раствора разбавляют аликвоту 100 мкмоль предварительно подогретой средой DMEM до концентрации 10 мкмоль. Встряхните рабочий раствор красителя в течение 5-10 секунд, чтобы обеспечить правильное перемешивание.
Теперь извлеките тестовую среду из каждой лунки перед тем, как поставить клетки карциномы. Затем аккуратно промойте каждую лунку с помощью ПБС. Пипеткой 100 микролитров рабочего раствора красителя в каждую лунку.
Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Удалите среду, содержащую ДГЭ, из каждой лунки. Используйте многоканальную пипетку, чтобы промыть каждую лунку три раза с помощью PBS.
Теперь пипеткой 200 микролитров PBS, содержащего ядерный краситель Hoechst 33342, в каждую лунку. После инкубации переложите планшет на просеивающую платформу с высоким содержанием. Запустите программное обеспечение для скрининга высокого содержания Cellomics CX7.
Откалибруйте платформу визуализации в соответствии со спецификациями производителя. Откройте системные параметры, специфичные для марки пластины, в базе данных приборов. Затем осторожно поместите планшет с образцами на нагретый столик системы визуализации.
Убедитесь, что пластина надежно закреплена и находится в правильной ориентации. Затем осторожно надавите на микропластину, чтобы убедиться, что она плотно прилегает к сцене. После того, как пластина будет правильно установлена, нажмите и удерживайте клавишу управления.
Затем нажмите «Управление» и «ОК», чтобы открыть диалоговое окно «Загрузка/выгрузка пластины». Чтобы выбрать параметры визуализации, откройте режим Target Activation (Активация мишени) в интерфейсе Cellomics BioApplications. Создание нового протокола для двухканального сбора данных, совместимого с ядерным окрашиванием и флуоресцентным зондом DHE.
Далее укажите необходимые объективы для получения изображения, затем выберите подходящее увеличение. Теперь укажите время экспозиции, изгиб камеры и интервал z-стека. После настройки параметров визуализации определите основной интересующий объект отслеживания, используя различные алгоритмы прибора.
После сегментации идентифицированного объекта проверьте первичный объект на основе конкретных параметров размера, формы и интенсивности, уникальных для каждого типа ячейки. Определите область интереса вокруг объекта и установите вокруг нее круг размером 20 микрометров. Перейдите на вкладку Population Characterization (Характеристика популяции), затем установите ограничение сканирования на 1000 ячеек на лунку с минимум 10 объектами на поле.
Теперь нажмите на Launch View, чтобы отсканировать каждую луночную пластину. Затем запустите программное обеспечение для анализа представлений и экспортируйте количественные параметры данных в формате CSV для дополнительного анализа. Воздействие перекиси привело к статистически значимому увеличению флуоресценции, индуцированной АФК, по всем клеточным линиям дозозависимым образом.
При приеме менадиона клетки JHH-4 показали дозозависимое увеличение интенсивности флуоресценции. Однако существенная разница во флуоресценции наблюдалась только при более высоких концентрациях в двух других клеточных линиях.
