Для начала установите на экспериментальную камеру ванны чистое стеклянное предметное стекло. Смажьте предметное стекло двумя-тремя микролитрами ламинина и дайте ему высохнуть в течение 30 секунд. Затем налейте примерно 400 микролитров суспензии мышечных волокон на предметное стекло и дайте волокнам прилипнуть к ламинину в течение 10-15 минут.
Поместите экспериментальную камеру на предметный столик инвертированного микроскопа, оборудованного для эпифлуоресценции. Чтобы проверить жизнеспособность волокон, поместите два платиновых электрода по обе стороны от экспериментальной камеры. После подачи прямоугольных импульсов тока в течение 0,8-1,2 миллисекунды наблюдайте за сокращениями мышечных волокон в крайних точках.
Загрузите волокна от 3,5 до 4,5 микромоляров быстрого кальциевого красителя Mag-Fluo-4 AM на четыре-пять минут в раствор Tyrode. После промывки предметного стекла раствором Tyrode дайте внутриклеточному красителю деэтерифицироваться в течение 15-20 минут в темноте. Во время регистрации кальциевых переходных процессов при приглушенном освещении сбор и сохранение световых сигналов с помощью масляного иммерсионного объектива 40X и фотоумножителя, подключенного к дигитайзеру.
В программном обеспечении для сбора данных обеспечьте масштаб от нуля до 200 условных единиц. Затем отрегулируйте размер пятна возбуждения и усиление фотоумножителя, чтобы установить флуоресценцию покоя, или F-rest, на 10 произвольных единиц. Для анализа записей установите фильтр нижних частот для всей трассы с частотой в один килогерц.
Затем отрегулируйте пик, чтобы рассчитать F-rest за одну секунду кривой. Установите F-rest на ноль и измерьте амплитуду пикового саркоплазматического кальциевого переходного процесса. Измерьте время нарастания от 10% до 90% амплитуды, продолжительность на полумаксимуме и время затухания от 90% до 10% амплитуды.
Затем оцените кинетику распада в соответствии с аппроксимацией с биэкспоненциальной функцией. Рассчитайте пиковую концентрацию кальция в микромолярах. Наконец, сохраним значения временных констант распада tau 1 и tau 2, а также амплитуд A1 и A2. Мышцы FDB и EDL показали кинетику кальция, известную как морфология типа II. Камбаловидные мышцы продемонстрировали морфологию кальциевых переходных процессов типа I.
Волокна мышц PDQA, PL и EHL имели общую морфологию II типа. Кинетические сигналы PDQA, PL и EHL кальциевого транзиента были сходны с сигналами мышц FDB EDL, но отличались от сигналов камбаловидных мышц.
