Флуоресцентно-активируемая сортировка гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

Для начала настройте флуоресцентно-активируемую сортировку клеток, или машину FACS, для сортировки клеток в соответствии с инструкциями производителя. Поместите пробирку с образцом на аппарат FACS и загрузите ее. Gate TMRM-high и ALCAM отрицательная популяция в области P1 для сортировки негепатоцитов.

Затем гейтируют популяцию с высоким уровнем TMRM и ALCAM в области P2 для сортировки гепатоцитов. Отсортированные клетки соберите в 15-миллилитровые пробирки, содержащие среду для созревания гепатоцитов. После сортировки извлеките сборную трубку из машины FACS.

Центрифугируйте отсортированную клеточную суспензию при 200 G в течение пяти минут при 18 градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах среды для созревания гепатоцитов с 10 микромолярным ингибитором горных пород и 20 наномолярным циклоспорином А. Засейте клетки мышиных эмбриональных фибробластов мыши, обработанных митомицином, средой для созревания гепатоцитов в шестилуночный планшет. Культивируйте клетки в инкубаторе углекислого газа с температурой 37 градусов Цельсия в течение пяти дней перед иммуноокрашиванием для теста на чистоту гепатоцитов.

Анализ FACS, проведенный на 27-е сутки печеночной дифференцировки, выявил высокий уровень TMRM и ALCAM-положительную популяцию. Показано иммуногистохимическое окрашивание клеток Р1 и Р2, культивируемых на эмбриональных фибробластах мышей после сортировки. Тест на чистоту путем подсчета альбумин-положительных клеток показал 0% P1, и примерно 97% P2-клеток были гепатоцитоподобными клетками.