Для начала используйте специфические праймеры 515f и 806r для амплификации гипервариабельной области V4 гена 16S рНА. Проводят ПЦР с использованием заданных условий. Далее добавьте в пробирку 3,5 микролитра буфера для секвенирования и 1,5 микролитра ферментной смеси.
После перемешивания и вращения образца настройте реакцию термоамплификатора. Теперь добавьте смесь для перевязки адаптера в пробирку и выдерживайте при температуре 20 градусов Цельсия в течение 15 минут в термоамплификаторе. Добавьте в смесь для лигирования 1,5 микролитра специфического реагента урацила и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.
Теперь добавьте 43,5 микролитра магнитных шариков в ДНК адаптера и перемешайте 20 раз. Через пять минут поместите трубку в магнитный штатив на пять-10 минут для отделения шариков и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулу 100 микролитрами 80% этанола и высушите шарики в течение 30 секунд.
Чтобы разбавить шарики в гранулах, добавьте в пробирку 8,5 микролитров 10 миллимоляра Tris HCl и выдерживайте в течение двух минут. Поместите пробирку в магнитный штатив и удалите 7,5 микролитров ускользающей ДНК в качестве надосадочной жидкости в новую пробирку. Добавьте ПЦР-реагенты в адаптер лигированной ДНК-содержащей пробирки, чтобы запустить реакцию объемом 25 микролитров.
Чтобы очистить амплифицированную ДНК, добавьте в пробирку 22,5 микролитра магнитных шариков и перемешайте 20 раз. Через пять минут удалите 50 микролитров надосадочной жидкости и промойте шарики 100 микролитрами 80% этанола. Суспензируйте темно-коричневые шарики в 16 микролитрах воды и перемешайте 20 раз.
Поместите пробирку в магнитную решетку на 30–60 секунд и переложите 15 микролитров в новую пробирку. Смешайте 90 микролитров буфера, один микролитр красителя и два микролитра образца библиотеки ДНК и считайте концентрацию ДНК на флуориметре. После разбавления ДНК до двух наномоляров загрузите от 27 до 30 микролитров проточной ячейки и поместите ее в секвенатор.
Сохраните файлы FASTQ, полученные из секвенсора. Нажмите, чтобы открыть файл электронной таблицы и создать файл сопоставления или метаданных. Откройте веб-сайт Nephele, загрузите файлы FASTQ и прочтите QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.
Затем, используя DADA2, выполните демультиплексированное парное чтение, замену фильтров, ошибки химеры и слияние. Используйте наивный байесовский классификатор, обученный на базе данных Silva версии 132 99% оперативной таксономической единицы, или OTU, для выполнения таксономического присвоения бактерий с 97%сходством. Откройте веб-сайт MicrobiomeDB.
Нажмите, чтобы загрузить файлы и сгенерировать альфа-разнообразие OTU, бета-разнообразие, относительное изобилие и кривые разрежения. Наконец, откройте электронную таблицу и перенесите данные, чтобы создать тепловые карты, диаграммы Венна и размер эффекта линейного дискриминантного анализа. Тепловая карта, основанная на относительном обилии бактерий на разных этапах виноделия, показала доминирование таких типов, как Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota и Fusobacteriota.
На уровне рода были идентифицированы такие важные роды, как Enterobacteriaceae и Lactobacillaceae. Анализ диаграммы Венна выявил 15 общих уникальных OTU от виноградного сусла до конечного вина. Результаты секвенирования ампликонов на основе вариабельной области V4 также показали альфа-разнообразие в двух траминетах R и L. Анализ разнообразия показал сдвиг бактерий во время брожения, но бактериальный состав в конечном вине был аналогичен бактериальному составу на стадиях добавления сусла и дрожжей.
