Сборка частиц Ha-CoV-2 путем котрансфекции HEK293T клеток для количественного определения вариантов SARS-CoV-2

Начните с содержания HEK293T клеток и DMEM, содержащих инактивированные теплом FBS, пенициллин и стрептомицин, в колбе T75. Для подсчета клеток смешайте 20 микролитров клеточной суспензии с 20 микролитрами раствора трипанового синего цвета. Добавьте 20 микролитров клеточной суспензии, смешанной с красителем, в камеру для подсчета клеток и подсчитайте количество клеток на миллилитр.

Семена HEK293T клетки и 10 миллилитров полного DMEM в 10-сантиметровой клеточной культуре чашки Петри. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день удалите всю среду и замените ее девятью миллилитрами среды, не содержащей сыворотки DMEM.

Используя данные соединения сборки вирусных частиц, приготовить котрансфекционную смесь. Медленно добавьте смесь в чашку Петри, и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести часов. После инкубации замените бессывороточную среду DMEM полной средой DMEM и продолжайте инкубацию для котрансфекции в течение 48 часов.

Затем отделите клетки путем многократного пипетирования по поверхности монослоя и переложите суспензию в 15-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400G в течение пяти минут. Соберите надосадочную жидкость и пропустите ее через фильтр 0,22 мкм.

Храните фильтрат, содержащий псевдовирус Ha-CoV-2, при температуре 80 градусов Цельсия.