Начните с поддержания HEK-293T ACE2 TMPRSS2 клеток в DMEM, содержащих нагретый активированный FBS, пенициллин и стрептомицин в колбе T75. Для подсчета клеток смешайте 20 микролитров клеточной суспензии с 20 микролитрами раствора Трипана Синего. Добавьте 20 микролитров клеточной суспензии, смешанной с красителем, в камеру для подсчета клеток, и подсчитайте количество клеток на миллилитр.
Затравите 2,5 умножить на 10 в степень четырех HEK-293T ACE2 TMPRSS2 ячейки по 50 микролитров полной среды DMEM в каждую лунку 96-луночного планшета. Инкубируйте клетки в инкубаторе с углекислым газом в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день замените 50 микролитров DMEM на 50 микролитров вирусной суспензии и инкубируйте в течение 18 часов при температуре 37 градусов по Цельсию.
После инкубации добавьте в каждую лунку по 7,5 микролитров буфера для лизиса клеток и перемешайте на орбитальном шейкере в течение двух минут. После того, как клетки лизируются, добавьте свежеприготовленный раствор для анализа люциферазы светлячков и перемешайте их на орбитальном шейкере в течение одной минуты. Анализируйте активность люциферазы с помощью коммерческого считывателя микропланшетов люциферазы.
Для анализа нейтрализующих антител засейте клетки HEK-293T в 50 микролитрах полного DMEM, как было показано ранее. В 96-луночный планшет добавьте восемь микролитров нейтрализующих антител 27 BV и выполните серийные разведения шестью микролитрами бессывороточного DMEM. Добавьте 54 микролитра частицы вируса Ha-CoV-2 к серийно разведанному антителу, и перемешайте суспензию.
Инкубировать в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Затем добавьте 50 микролитров вирусной суспензии в лунки, содержащие клетки HEK-293T. Для контроля добавьте 50 микролитров полной среды DMEM в лунки, содержащие только элементы HEK-293T.
Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 18 часов. После лизиса клеток, как показано ранее, добавьте свежеприготовленный раствор для анализа люциферазы светлячков и перемешайте путем орбитального встряхивания в течение одной минуты. Анализируйте активность люциферазы с помощью коммерческого считывателя микропланшетов люциферазы.
Варианты Ha-CoV-2 Omicron и Omicron генерируют в четыре-десять раз больше сигнала, чем Ha-CoV-2 дикого типа, что свидетельствует о более высокой заразности. Антитело 27 BV продемонстрировало нейтрализующую активность в отношении вариантов Дельта и Омикрон. ID50 27 BV для Omicron был примерно в 10 раз менее мощным, чем ID50 для Wild-type и Delta.
