Трехполосные штаммы шигелл на агаровых пластинах, содержащих краситель Congo Red, для обеспечения вирулентности колоний и предотвращения использования невирулентных колоний в анализах на инфекции. Для начала возьмите выращенные за ночь культуры шигелл и взбейте их. Добавьте 100 микролитров культуры к пяти миллилитрам свежего БСЭ в пробирке для культивирования.
Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании при 250 об/мин до достижения оптической плотности 0,7 на длине волны 600 нанометров. Переносят 2 раза по 10 на 8 колониеобразующих единиц субкультивируемой шигеллы в пробирки микроцентрифуги объемом 2 миллилитра. Гранулированные ячейки центрифугируют при 17 000 г в течение двух минут при комнатной температуре.
Аспирировать надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр теплого PBS и тщательно взвесьте гранулу. После повторного центрифугирования клетки повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах теплого DMEM и встряхните клеточную суспензию.
Затем добавляют один миллилитр ресуспендированной шигеллы и один миллилитр DMEM в каждую лунку монослоев эпителия толстой кишки HT29 в шести планшетах. Чтобы обеспечить бактериальный контакт с клетками HT29, центрифугируйте шесть луночных планшетов при 2 000 г в течение 10 минут при комнатной температуре или 37 градусах Цельсия. Инкубируйте шесть луночных планшетов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 45 минут.
Для определения титра бактериальной инфекции готовят десятикратные серийные разведения ресуспендированных клеток шигелл в PBS. Распределите 100 микролитров 1 раз по 10 к 5 и 1 раз по 10 к 6 разведениям на красные тарелки Конго с БСЭ и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации отсасывайте среду из каждой лунки.
Добавьте по одному миллилитру теплого PBS в каждую лунку и аккуратно промойте. Затем добавьте два миллилитра теплого ДМЕМ с 50 микрограммами на миллилитр гентамицина и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5%-ным углекислым газом. Промойте инфицированные клетки HT29 три раза одним миллилитром PBS.
Добавьте в каждую лунку по два миллилитра теплого ДМЕМ с гентамицином и инкубируйте до 24 часов для внутриклеточной репликации при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. По окончании инкубации промойте клетки два раза одним миллилитром ПБС. Добавьте один миллилитр PBS с 1% Triton X-100 в каждую лунку для лизиса клеток HT29.
Затем с помощью скребка для клеток или изогнутого наконечника пипетки соскребите лизированные клетки со дна лунок и перелейте смесь в пробирку микроцентрифуги объемом 1,7 миллилитра. Встряхните каждую пробирку не менее 30 секунд, чтобы еще больше вытеснить шигеллы из лизированных эукариотических клеток. Готовят десятикратные последовательные разведения лизатов и ПБС.
Выложите 100 микролитров серийных разведений на красные тарелки Конго с БСЭ и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.
