Чтобы начать хвостохранилище, приготовьте 20-микролитровую смесь на льду с общей РНК, хвостовой буферной смесью и смесью хвостовых ферментов. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут в амплификаторе. Затем добавьте раствор для хвостового упора и держите на льду две минуты.
Выполните обратную транскрипцию и амплификацию ПЦР. После гель-электрофореза с высоким разрешением продуктов ПЦР получите доступ к данным с помощью программного обеспечения. Откройте файл XAD и выберите имена образцов или многозвенную цепь на панели Tree View.
Увеличивайте и уменьшайте масштаб электроферограмм и гелеобразных изображений для детального отображения. Чтобы получить размеры пиков, откройте электроферограмму выбранного образца. Щелкните правой кнопкой мыши по электроферограмме и выберите ручную интеграцию, чтобы вручную выбрать пики, перетащив горизонтальную линию.
Обратите внимание на значения пиков в таблице пиков и определите пик с наибольшей высотой пика. Включите значок «Показать/скрыть уставки» в верхнем меню. С правой стороны появится новая панель.
Выберите «Дополнительно», прокрутите вниз до пункта «Выполнить анализ мазка» и установите флажок. Таблица Region (Регион) будет добавлена на вкладку Electropherogram (Электроферограмма). Затем выберите электроферограмму и перейдите в таблицу Region.
В меню «От базовой пары» и «До базовой пары» задайте начальную и конечную базовые пары, щелкнув правой кнопкой мыши электроферограмму и выбрав область для добавления. Щелкните правой кнопкой мыши любую ячейку в таблице «Регионы» и выберите «Изменить регионы», чтобы создать новое небольшое всплывающее окно для установки пользовательских областей. Используйте это уравнение для вычисления длины поли(А)хвоста на интересующей мРНК.
Далее на вкладке Электроферограмма отметьте Показать размеры, чтобы автоматически преобразовать таблицу Region из базовой пары в среду выполнения. Откройте CSV-файл и выберите значения, полученные для среды выполнения, чтобы построить график. Используя этот протокол, были проанализированы длины поли(А)хвостов генов Dscam1 и GAPDH из головного мозга личинок дрозофилы, в то время как продукты ПЦР из ген-специфичных пар праймеров показали одну полосу.
Продукты ПЦР из ген-специфичных пар универсальных праймеров показали отчетливые паттерны мазка, указывающие на дифференциальную поли(А)длину мРНК. Средние длины поли(А)хвостов были получены с помощью анализа мазка. А диапазон длин хвостов был представлен электроферограммами.
Аналогичным образом, анализ длины поли(А)хвоста на клетках S2 показал дифференциальную длину поли(А)хвоста для генов SV43 prime UTR и GAPDH.
