Для начала вырастите выбранный дрожжевой трансформант в трех миллилитрах среды SD URA при температуре 30 градусов Цельсия до достижения насыщения. Измерьте оптическую плотность культуры на длине волны 600 нанометров. Центрифугируют два миллилитра ночной культуры при 14 000 G при комнатной температуре.
Пипеткой выдавите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера MES. Центрифугируют смесь при 14 000 Г при комнатной температуре.
Затем удалите надосадочную жидкость. После еще одной промывки ячеек MES-буфером ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах MES-буфера. Затем перелейте весь объем в резервуар с реагентом.
Далее настройте считыватель микропланшетов. Перейдите к значку управления протоколом, затем установите тип измерения на интенсивность флуоресценции и режим чтения на спектральное сканирование. Введите имя микропластины в GREINER 96 F BOTTOM и установите нижнюю оптику.
Чтобы получить доступ к настройкам оптики, выберите установить сканирование над излучением. Отрегулируйте длину волны возбуждения до 433 нанометров с шириной полосы возбуждения 10 нанометров. Установите диапазон длин волн излучения от 460 нанометров до 550 нанометров с шириной полосы излучения 10 нанометров и шириной шага один нанометр.
Установите время настройки на 0,1 секунды. Теперь приготовьте раствор хлорида натрия различной концентрации в лунках 96 лунок с чистым дном черной пластины. Загрузите 150 микролитров буфера MES в первые три лунки ряда А. Затем пипеткой 150 микролитров соответствующего раствора осмолита в порядке возрастания слева направо.
С помощью 12-канальной микропипетки промытую дрожжевую суспензию несколько раз. Затем перелейте в каждую лунку по 50 микролитров клеточной суспензии. Пропипетируйте содержимое каждой лунки несколько раз, чтобы обеспечить равномерное перемешивание.
Немедленно измерьте спектры интенсивности излучения флуоресценции. Наблюдайте за спектрами флуоресцентного излучения, отображаемыми на экране. Конструкции IDR отображали комбинацию эмиссионных спектров mCerulean3 и цитрина.
Для AtLEA45 гиперосмотический стресс вызывал увеличение интенсивности флуоресценции акцептора при снижении интенсивности флуоресценции донора. В альбуминовой конструкции этого не наблюдалось.
