Одномолекулярная визуализация гало-меченых белков для изучения взаимодействия белка с конденсатом

1 Для начала приобретите лиганд для окрашивания клеток 2,экспрессирующих галометированный белок и гало H2B. 3 После включения системы микроскопа 4 установите параметры инкубации живых клеток 5 и дайте системе уравновеситься. 6 Нанесите каплю масла на объектив 7 100x TIRF на микроскоп 8 и загрузите образец клетки на предметный столик микроскопа.

9 Чтобы идентифицировать морфологически здоровую клетку, 10 отрегулируйте положение Z 11 и визуализируйте образец клетки при яркопольном освещении. 12 Обрежьте поле зрения, чтобы захватить ядро клетки-мишени. 13 Используя лазерное освещение, отрегулируйте угол TIRF 14 для достижения освещения hilo с оптимальным соотношением сигнал/шум 15 для одной молекулы.

16 Затем установите время экспозиции на 500 миллисекунд. 17 В течение мертвого времени между кадрами 18 фото активируют молекулы 19 с помощью луча мощностью 111 микроватт 405 нанометров, 20 и во время каждой экспозиции возбуждают молекулы ореола H2B 21 лучом мощностью 9,1 милливатт 640 нанометров. 22 Инициируйте захват изображения в течение 2000 кадров непрерывно 23 и постепенно увеличивайте мощность луча 24 длиной 405 нанометров по мере уменьшения количества фотоактивированных молекул.

25 Для представляющего интерес белка с галометкой 26 разделить длины волн излучения между двумя камерами 27 с помощью длинного дихроичного зеркала. 28 К тем же параметрам захвата, которые были продемонстрированы ранее, 29 добавьте канал JFX549 для захвата одного кадра каждые 10 секунд 30 и захвата 2000 кадров непрерывно.